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抗乙肝病毒表面抗原 Pres1 （ 20-47 ）的单链抗体在 转基因烟草根分泌物中的初步表达 甘 强! 金礼吉 聂明珠 胡学军 安利佳 （大连理工大学生物工程系 大连 116024 ） 摘 要 为探索利用植物根分泌表达重组蛋白的可行性，构建了含有抗乙肝病毒表面抗 原 PreS1 （ 20-47 ）单链抗体（ ScFV ）基因的表达载体。该 ScFV 基因转化烟草后在烟草根部 细胞的细胞质和内质网中获得表达。实验结果表明， 5 ’端融合 ER 导向信号肽的重组 ScFV 可通过根分泌表达。 关键词 乙肝病毒表面抗原 PreS1 ，单链抗体，转基因烟草，根分泌，表达 0 引 言 自 1989 年 Hiatt 等人［1 ］在植物中表达抗体以 来，多种基因工程抗体、酶、激素、血浆蛋白和疫苗等 都已在植物的叶、茎、根、果实、种子以及植物细胞和 器官中得到表达，然而提取和纯化始终是大规模利 用植 物 生 产 重 组 蛋 白 的 主 要 障 碍。 1999 年， Boris j uk 等［2 ］依据内质网（ ER ）和 ER 信号肽在蛋白 质合成中的作用，把 3 种重组蛋白定位到质外体中， 通过植物根分泌获得表达，从而建立了新的重组蛋 白表达系统———植物根分泌，简化了分离和纯化程 序，为利用转基因植物大规模生产重组蛋白提供了 潜在的途径。 文献报道指 出，乙 肝 病 毒 表 面 抗 原（ HBsA g ） p reS1 肽段在 HBsA g 与肝细胞结合过程中起重要作 用，而 在 p reS1 100 多 个 残 基 中 起 关 键 作 用 的 是 p reS1 （ 21-47 ）这段序列，抗 p reS1 （ 21-47 ）的抗体具 有中和乙肝病毒的能力［3 ，4 ］。多种带 p reS1 （ 21-47 ） 片段的乙肝疫苗已在哺乳动物细胞、毕赤酵母和大 肠杆菌中得到表达［5-8 ］。最近，抗 PreS1 （ 21-47 ）的 单链抗体在转基因烟草中也获得了 表达［9 ，10 ］。然而目前为止还没 有 利用植物根分泌表达系统表达抗 PreS1 （ 21-47 ）的单链抗体的报道。 本实验室采用噬菌体展示技术构建 了全人源性抗乙肝病毒表面抗原 PreS1 （ 20-47 ）单链抗体［11 ］。本文报道这个单链抗 体在植物根分泌中的初步表达情况。 1 材料与方法 1 .1 材料 1 .1 .1 菌株和质粒 农杆菌菌株 LBA4404 和植物表达载体 p CAM- BI A1301 为本实验室保存。带 # 增强子的 35S 烟 草花叶病毒启动子由上海农业科学院张大兵研究员 赠送。烟草品种为 Nicotiana tobacum NC 89 。 1 .1 .2 主要试剂和仪器 ECL TM核酸标记与检测系统和单链抗体检测试 剂［包括 HRP ／ anti- E ta g 抗体和显色底物 ABTS （ 2 ， 2 azino- bis- （ 3-eth y l- benzthiazoline-6 sul p honate ）］购自瑞 典 Amersham Phamarcia Biotech 公司；偶联 BSA 的 PreS1 （ 20-47 ）肽（ 氨 基 酸 序 列 为： APLGFF- PDHGLDPAFGANSNNPDWDFNP ）由中国科学院 上海生物化学研究所崔大敷教授提供；分子克隆所 用的酶及试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公 司；其他常用试剂均为国产分析纯试剂。主要仪器 有 Phar macia Biotch I maz g eMaster ! VDS 电泳成像 系统、高速冷冻离心机 - CF15R （日立公司）。 1 .2 方法 1 .2 .1 植物表达载体的构建 为研究抗 PreS1 （ 20-47 ）的单链抗体在烟草根分 泌物中的表达，构建了 2 种植物表达载体（见图 1 ）。 ScFO 基因是通过引物： — 53 — 甘 强等：抗乙肝病毒表面抗原 PreS1 （ 20-47 ）的单链抗体在转基因烟草根分泌物中的初步表达 ! 联系人。 （收稿日期： 2003-01-27 ） 男， 1977 年生，硕士生；研究方向：基因工程药物。 F1 ： 5 ’ - ATCCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCA-3 ’ Nco I R2 ： 5 ’ - GCTAGCTGCGGCACGCGGTTCCAG-3 ’ Nhe I 从质粒 ZG1 ［ 12 ］中扩增得到的。扩增条件为： 94 C 1mi n ； 98 C 变性 10Sec ， 55 .5 C 退火 30Sec ， 72 C 延伸 30Sec ，共 30 个循环； 72 C 5mi n 。这 2 种表达载体 的构建如图 1 所示。表达载体 ! 的 ScFO 基因 5 ’端 融合