现代分子诊断的技术.pptVIP

第七章 现代分子诊断技术;基因诊断;传统的诊断程序 先要对病原物质进行培养，培养后再分析它的生理学特性 确定它到底是哪一类的病原物，是病毒、细菌，还是其他物质 实践证明:比较有效,检测到病原微生物相对比较特异 诊断成本高、速度慢、效率低 如砂眼衣原体、朊病毒;方法;现代分子诊断技术主要是指应用免疫学和分子生物学的方法对病原物质进行诊断检测 一种有效的诊断方法应具备： 1、专一性（specificity）强，诊断只对某一种病原菌分子产生阳性反应 2、灵敏度(sensitivity)高 3、操作简单(simplicity);基因诊断的特点;基因诊断优点;基因诊断常用的技术;DNA Southern blot, FISH,PCR, Sequencing, micoarray, restriction analysis, RFLP，SSCP RNA Northern blot, RT-PCR, micoarrays Protein Western blot, Immuno-histochemistry, microarray ;Southern blot; FISH;PCR技术;DNA测序; 指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息） ;DNA芯片技术原理;DNA芯片技术流程;;基因诊断的原理;基因治疗的机理; ????????????????????????????????????????????????????????????????????????;;;; 分子诊断; 分子诊断;第一节酶联免疫吸附测定;一、酶联免疫吸附测定的原理;二、检测过程： ①将待测样品结合在固相支持物（如96孔的微量滴定板）上 ②加入可以与目标分子特异反应的抗体，即一抗（primary antibody）,反应后冲洗，将未结合上的一抗洗去 ③加入二抗（secondary antibody），二抗通常只特异地识别一抗，而不识别目标分子（二抗上还连着一种酶，如碱性磷酸酶、过氧化物酶或脲酶等，这些酶都能够催化一种化学反应将无色底物转变成有色物质），一抗与二抗反应完成后，再次冲洗将未与一抗结合的二抗洗去 ④加入无色底物;双抗体夹心法;间接法;竞争法;双夹心法;3、使用多克隆抗体的缺点 ①同一抗体混合物中不同抗体的含量会有差异，而且每次制备的抗体的量之间也会有差异 ②无法区别相类似的目标分子：如果病原分子与非病原分子之间只相差一个抗原决定簇，这时多克隆抗体就无法区分，因为在ELISA检测中都会发生颜色变化 单克隆抗体特异性强 只结合抗原上某一单一位置;4、酶联免疫吸附测定的局限性 仅凭ELISA结果容易造成误诊，ELISA检测只能作为一种初步的检测手段，要进一步确诊还必须进行western检测 要提高ELISA检测的准确度,就必须提高一抗的特异性 在使用抗体时，要求其抗原的编码其目标识别位点的基因要表达，而且目标位点不能够以任何方式被覆盖或阻断，否则都将影响抗体与抗原的结合;第二节 DNA诊断系统;一、核酸杂交;主要依据： 碱基互补、变性和复性 DNA与DNA杂交： A=T、 G≡C ; DNA与RNA杂交: A=U、 G≡C ; 变性： 在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链； 复性： 随温度逐渐恢复，变性的两条单链重新形成互补双链;;核酸分子杂交（固相杂交）操作程序 ;3、杂交探针; 利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同源核酸序列的存在 核酸探针 是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同源序列 探针标记物 有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、荧光素等）两大类;分离杂交探针的方法： 提取某一病原微生物株系的染色体DNA 限制性内切酶进行酶解 得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库 文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性微生物和非病原性微生物的核DNA进行杂交、筛选;核酸杂交的灵敏度和可靠性极高 用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组织样品中的目标DNA进行杂交，且无需预先纯化DNA 若样品中的目标分子非常少，则需通过PCR将目的序列扩增，再进行杂交检测 从理论上