免疫标记技术学案.doc

课程名称：临床免疫学检验技术 课题名称：免疫标记技术 组员：朱恩鹏 拉巴卓嘎 张燕培 汪婷婷 免疫标记技术 免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。藉助于荧光显微镜、射线测量仪、酶标检测仪、和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定，可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。近年来，随着分子生物学、细胞生物学、基础免疫学和免疫化学等学科的发展以及现代高新技术建立的仪器分析的应用，免疫标记技术也不断完善和更新。各种新技术和新方法不断涌现，至今已成为一类检测微量和超微量生物活性物质的免疫生物化学分析技术，在医学和其他生物学科的研究领域及临床检验中应用十分广泛。 根据试验中所用标记物的种类和检测方法不同，免疫标记技术分为免疫荧光技术、放射免疫技术、免疫酶技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术和发光免疫测定等。 第一节 放射免疫技术 放射免疫标记技术是将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法，由于此项技术具有灵敏度高(可检测出毫微克(ng)至微微克(pg)，甚至毫微微克(fg)的超微量物质，特异性强(可分辨结构类似的抗原)、重复性强、样品及试剂用量少、测定方法易规范化和自动化等多个优点。因此，在医学及其他生物学科的研究领域和临床实验诊断中广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。 （一）放射免疫测定(RIA) 　　放射免疫测定(Radio immunoassay，RIA)是1959年Yalow和Berson首先创建的经典放射免疫分析技术，用于血清中胰岛素含量的测定。30多年来，由于此项技术灵敏、特异、并已制成多种标准试剂盒，使用方便，应用范围十分广泛。目前国外已成功地应用RIA检测的物质多达300余种，国内研究的被测物质也达百余种，试制的RIA试剂盒已有60余种，是测定各种微量物质不可缺少的手段。 　　（二）免疫放射测定 (IRMA)　　1968年Miles和Hales应用同位素标记的抗胰岛素抗体检测牛血清中胰岛素获得成功，为了区别于经典的放射免疫测定(RIA)，他们将其称为免疫放射测定或免疫放射度量分析(IRMA)。由于在反应系统中使用过量的标记抗体，且无竞争性抑制反应，因此抗体与待测抗原达到结合状态的化学平衡，在2-3h即可完成，较少受到抗体亲和常数的限制，即使单克隆抗体的亲和力较低，也能满足试验要求。同时一个抗原分子可以结合多个标记抗体分子，使IRMA的灵敏度明显高于RIA。　　基本原理：IRMA是待测抗原与过量标记抗体的非竞争综合反应，然后加入固相的抗原免疫吸附剂以结合游离的标记抗体，离心除去沉淀，测定上清液中放射性强度．从而推算出检品中抗原含量。 第二节 免疫荧光技术 免疫荧光技术又称荧光抗体技术，是将免疫反应的特异性与荧光技术的敏感性及显微术的精确性相结合的免疫标记技术。以荧光素作为标记物与抗体结合成为荧光抗体，但不影响抗体的免疫学活性。用已知的荧光抗体检测待检标本中的未知抗原，如果彼此相互对应，则在局部形成荧光素标记的抗原抗体复合物。荧光素受到紫外光照射时能发出可见荧光，可借助荧光显微镜观察呈现荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。近年来，免疫荧光技术已有很大改进和发展，已从原来仅限于固定标本，检测组织切片或细胞表面Ag或血清中抗体的定性检测，扩大到进行活细胞分类检测及多种成分的定量检测，因此具有较广泛的用途。 荧光及荧光素 荧光是指-个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是-种能吸收激发光的光能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明及四甲基异硫氰酸罗丹明。  （二） 荧光抗体染色方法 　　直接法：这是荧光抗体技术最简单和基本的方法。滴加荧光抗体于待检标本片上，经反应和洗涤后在荧光显微镜下观察。标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体特异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。此法的优点是简单、特异。但其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法。　　间接法：先将待测抗体(第一抗体)加在含有已知抗原的标本片上作用一定时间，洗去未结合的抗体。然后，滴加标记抗抗体。如果第一步中的抗原抗体已发生结合，此时加入的标记抗抗体就和已固定在抗原上的抗体(一抗)分子结