GATK使用方法教程.docx

GATK使用方法详解（包含bwa使用）第一部分 ? 一、使用GATK前须知事项： （1）对GATK的测试主要使用的是人类全基因组和外显子组的测序数据，而且全部是基于illumina数据格式，目前还没有提供其他格式文件（如Ion Torrent）或者实验设计（RNA-Seq）的分析方法。 （2）GATK是一个应用于前沿科学研究的软件，不断在更新和修正，因此，在使用GATK进行变异检测时，最好是下载最新的版本，目前的版本是2.8.1（2014-02-25）。下载网站： HYPERLINK /gatk/download /gatk/download。 （3）在GATK使用过程中（见下面图），有些步骤需要用到已知变异信息，对于这些已知变异，GATK只提供了人类的已知变异信息，可以在GATK的FTP站点下载（GATK resource bundle）。如果要研究的不是人类基因组，需要自行构建已知变异，GATK提供了详细的构建方法。 （4）GATK在进行BQSR和VQSR的过程中会使用到R软件绘制一些图，因此，在运行GATK之前最好先检查一下是否正确安装了R和所需要的包，所需要的包大概包括ggplot2、gplots、bitops、caTools、colorspace、gdata、gsalib、reshape、RColorBrewer等。如果画图时出现错误，会提示需要安装的包的名称。 ? 二、GATK的使用流程  GATK最佳使用方案：共3大步骤。原始数据的处理—变异检测—初步分析。 ? 第一大步：原始数据的处理 ? 1.?对原始下机fastq文件进行过滤和比对（mapping） 对于Illumina下机数据推荐使用bwa进行mapping。 ? Bwa比对步骤大致如下： （1）对参考基因组构建索引： ?????例子：bwa index -a bwtsw hg19.fa。最后生成文件：hg19.fa.amb、hg19.fa.ann、hg19.fa.bwt、hg19.fa.pac和hg19.fa.sa。 ?????构建索引时需要注意的问题：bwa构建索引有两种算法，两种算法都是基于BWT的，这两种算法通过参数-a is?和-a bwtsw进行选择。其中-a bwtsw对于短的参考序列是不工作的，必须要大于等于10Mb；-a is是默认参数，这个参数不适用于大的参考序列，必须要小于等于2G。 （2）寻找输入reads文件的SA坐标。 ?????对于pair end数据，每个reads文件单独做运算，single end数据就不用说了，只有一个文件。 ?????例子：pair end： bwa??aln??hg19.fa??read1.fq.gz??-l 30??-k 2??-t 4??-I?? read1.fq.gz.sai bwa??aln??hg19.fa??read2.fq.gz??-l 30??-k 2??-t 4??-I?? read2.fq.gz.sai single end： bwa??aln??hg19.fa??read.fq.gz??-l 30??-k 2??-t 4??-I?? read.fq.gz.sai 主要参数说明： -o int：允许出现的最大gap数。 -e int：每个gap允许的最大长度。 -d int：不允许在3’端出现大于多少bp的deletion。 -i int：不允许在reads两端出现大于多少bp的indel。 -l int：Read前多少个碱基作为seed，如果设置的seed大于read长度，将无法继续，最 好设置在25-35，与-k 2?配合使用。 -k int：在seed中的最大编辑距离，使用默认2，与-l配合使用。 -t int：要使用的线程数。 -R int：此参数只应用于pair end中，当没有出现大于此值的最佳比对结果时，将会降低标 准再次进行比对。增加这个值可以提高配对比对的准确率，但是同时会消耗更长的 时间，默认是32。 -I int：表示输入的文件格式为Illumina 1.3+数据格式。 -B int：设置标记序列。从5’端开始多少个碱基作为标记序列，当-B为正值时，在比对之 前会将每个read的标记序列剪切，并将此标记序列表示在BC SAM?标签里，对于 pair end数据，两端的标记序列会被连接。 -b?：指定输入格式为bam格式。bwa??aln??hg19.fa??read.bam?? read.fq.gz.sai ? （3）生成sam格式的比对文件。如果一条read比对到多个位置，会随机选择一种。 ?????例子：single end：bwa??samse??hg19.fa??read.fq.gz.sai??read.fq.gz?? read.fq.gz