第8章分子生物学研究方法.pptVIP

第三节 DNA重组技术;DNA重组的一般步骤;3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。;酶?????? 类; 1. 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 2.?至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3.?至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞 4. 安全性;（二）类型;（1）pBR322质粒载体;（2）pUC质粒载体;（3）pGEM-3Z质粒;2、噬菌体;（2）λ噬菌体; 温和噬菌体 一般以溶源生长进行增殖，胁迫条件下也会进入溶菌生长周期。 复制 溶源周期随溶源细菌染色体一起复制 溶菌周期的早期是“θ”复制，晚期进行滚环复制 基因组成 ?DNA至少包括61个基因，大多基因按功能相似性成簇排列，其中一部分为噬菌体生命活动的必须基因，另一部分约1／3为非必须区段。 ;B. 类型 插入型 （Insertion vectors ） 这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。 如：λgt10 、 λgt11 克隆能力小，不到10kb 置换型 （Replacement vectors） 这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的λDNA区段是λ噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。 如Charon 4 载体 克隆能力大，20～25kb;（3）M13噬茵体;复制与增殖;3、柯斯质粒载体;柯斯质粒具有下列特点： ① 具有质粒载体的特性。 ② 带有λ噬菌体的粘性末端(cos区)。 ③ 一个或多个酶切位点。 ④ 具有高容量的克隆能力。 ⑤ 非重组体粘性质粒很小，不能在体外包装，因而有利于重组体的筛选。 ;4、病毒载体;常用的病毒载体的特点：;优点：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； 2、复杂的装配过程由细胞完成； 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。;二、质粒DNA的提取;（1）碱裂解法 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是根据Birnboim和Doly（1979）以及Ish-Horowicz和Burke（1981）的方法修订而成。 优点：收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的DNA重组操作。 基本原理：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。用酒精沉淀法可以收集仍然滞留在上清液中的质粒DNA。;纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。;上清液 加入固体CsCl与EtBr溶液 室温下超速离心(45,000rpm）16小时 穿孔取出DNA（320nm） 异丙醇抽提溴乙锭 缓冲液透析除去残余CsCl 两倍体积冷乙醇沉淀DNA 离心、洗涤、干燥;缺点 ; 根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。 Ⅰ类和Ⅲ类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖ATP的限制性内切酶活性。 Ⅰ类限制性内切酶结合于特定识别位点，且没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异性切割末端。 Ⅲ类限制性内切酶在识别位点上切割，然后从底物上解离下来。 故Ⅰ类和Ⅲ类酶在基因工程中基本不用。;Ⅱ型酶;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;（一） DNA的连接 1、DNA连接酶 T4 DNA连接酶（需要ATP作为辅助因子）主要用于：（1）连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段；（2）双链DNA分子间的平端；（3）在双链平端的DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。 2、粘性末端连接 连接后可能出现以下问题：（1）载体自身环化，造成假阳性背景克隆，为避免此问题，可在连接前，用碱性磷酸酶将载体DNA 5’- 端去磷酸化，这样只有载体和插入片段之间才能发生连接；（2）插入片段可双向插入；（3）插入片段可多拷贝插入。;3、平端连接