新生大鼠心肌细胞的原代培养的论文.docVIP

　　新生大鼠心肌细胞的原代培养的论文 【摘要】 目的：探讨新生大鼠心肌细胞的分离和培养方法。方法：应用0.0625%的胰蛋白酶重复消化出生第2 d乳鼠的心肌组织多次,收集的细胞用含10%胎牛血清的dmem培养基中和，用差速贴壁分离法分离，在以溴脱氧尿嘧啶（brdu）纯化心肌细胞后置co2培养箱孵育7 d。结果：分离1只乳鼠获得的心肌细胞产量约为140万个，且有活力心肌细胞占90％以上；培养4～6h的乳鼠心肌细胞开始贴壁生长,12～24h明显增殖,3～4 d后细胞融合成片；心肌细胞由圆形变为梭形、星形、多角形,并出现自发性节律性搏动。结论：本研究应用的心肌细胞原代培养方法可获得高产量、高活力的心肌细胞，是一种可靠的心肌细胞培养方法。 【关键词】 心肌；细胞培养技术；大鼠 primary culture of neonate rattus cardiocyte/ma fang|fang，shen xiao|li，lin li|fang，han li|li//chinese journal of cardiovascular rehabilitation medicine,2009，18（2）:125 abstract：objective:to explore the primary cultures method of neonatal rat cardiomyocytes.methods:cardiac muscle of tem medium,.myocardial cells in and illion cardiocytes can be obtained from one rat and the vital cell and polygon shape in the visual field of inverted microscope.all cells stretched out parapodium and beated spontaneously and rhythmically.conclusion:a great quantity and high survival rate cardiocytes can be effectively and quickly cultured by this method. author′s　address：fujian provincial hospital，fujian medical university，fuzhou,fujian,350001，china key yocardium;cell culture techniques;rat 自1960年haracy等[1]首次对乳鼠的心肌细胞进行培养以来，国内、外许多学者对心肌细胞原代培养方法进行了研究。.体外培养的心肌细胞能够保持其在体内原有的许多结构和功能，同时排除了神经、体液等因素的干扰，因此体外培养在心肌细胞的生长、发育、生理、代谢、病理等研究中具有重要意义。然而心肌细胞在分离过程中易受损伤,活细胞也很少分裂，且不易传代,因此提高心肌细胞产量和活力是许多学者研究的目的。本实验参照simpson p等[2]心肌细胞的培养方法并作了改进，探讨了乳鼠心肌细胞培养的方法，对心肌细胞形态、搏动状况进行观察，并对其纯度进行了鉴定，从而获得高产量、高活力的心肌细胞。 1 资料与方法 1.1 材料 实验动物：选择出生第2 d的sd乳鼠,雌雄不拘（由福建省医学科学研究所实验动物中心提供）。主要仪器与试剂:二氧化碳培养箱，olympus倒置显微镜,超净工作台，低速自动平衡离心机,恒温磁力搅拌器;dmem 培养基( hyclonc 公司)、胎牛血清( hyclonc 公司)、胰蛋白酶(gibco 公司)、d-hank′s 液( hyclonc 公司)、溴脱氧尿核苷(brdu，sigma公司) 、小鼠抗大鼠sarerie actin 单抗(博士德公司)；山羊抗小鼠igg(博士德公司)。 1.2 方法 1.2.1 心肌细胞的分离:取第2 d的sd乳鼠，无菌条件下开胸取心尖部，用预冷的d-hank′s 液洗涤3遍，将心脏剪成约1mm3大小；用0.0625％的胰酶在37℃恒温磁力搅拌器中消化心肌组织，消化过程中采用分次消化时间(5min×5次,6min×5次,7min×5次,8min×5次)，第一次消化后自然沉淀并弃上清，以后自然沉淀后取上清；每次分离的上清液加等量含10％胎牛血清的dmem培养液轻轻吹打制成细胞悬液，1 000 r/min离心10 min，重复3次。 1.2.2 心肌细胞的培养:细胞悬液放co2培养箱培养90min后，采用差速贴壁分离技术,吸收培养瓶中的细胞悬液，调整细胞浓度为5.0×105细胞