秦艽总苷对人肝癌细胞SMMC.docVIP

　　秦艽总苷对人肝癌细胞SMMC 【摘要】 目的观察秦艽总苷对肝癌细胞增殖及凋亡的影响。方法mtt法检测秦艽总苷对人肝癌smmc-7721细胞生长的影响，流式细胞仪分析细胞凋亡率，瑞-姬氏染色观察细胞形态变化。结果秦艽总苷浓度为125，250， 500，1 000 μg/ml时，smmc-7721细胞的生长受到不同程度的抑制，且有时间和浓度依赖性;流式细胞术检测显示一定浓度的秦艽总苷可诱导smmc-7721细胞凋亡；倒置显微镜下smmc-7721细胞出现细胞凋亡的形态学改变。结论一定浓度的秦艽总苷对人肝癌细胞smmc-7721有抑制增殖和诱导凋亡的作用。 【关键词】 秦艽总苷；smmc-7721细胞；凋亡 中药秦艽味苦、辛，性平,具有清热、除湿、止痛的功效。关于秦艽药理学方面的研究证明,秦艽具有抗炎、抗菌、抗病毒、解热、镇痛、免疫调节、保肝利胆等作用［1～9］。本研究以人肝癌细胞smmc-7721为研究对象，观察秦艽总苷对smmc-7721细胞的生长、细胞凋亡以及形态方面的影响，并以龙胆苦苷（gt;99%）作对照，比较相同浓度下对细胞作用的强弱。现报道如下。 　　1 材料与仪器 　　1.1 样品 　　秦艽总苷(艽龙胶囊)购自西安正大制药有限公司，龙胆苦苷标准品（gt;99%）购自上海华美工程公司。.秦艽总苷用pbs溶解，20 μl过滤除菌，获1 g/ml储备液备用；龙胆苦苷用pbs溶解，20 μl过滤除菌，获104 μmol/l备用。 　　1.2 细胞系 　　smmc-7721细胞由南京中医药大学药理实验室提供。 　　1.3 试剂 　　胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司，dmem培养液购自gibco公司，annexinv-fitc凋亡试剂盒购自凯基生物科技发展有限公司，瑞-姬氏染液购自南京建成生物工程研究所。 　　1.4 仪器 　　细胞培养箱（ht151）购自上海力申科技有限公司，酶联免疫检测仪（sunrise）购自瑞士tecan公司，bd facscalibur流式细胞仪购自北京希尔诚兴业科技有限责任公司。 　　2 方法 　　2.1 smmc-7721细胞培养 　　smmc-7721细胞用含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素、100 mg/ml链霉素的dmem培养液，在37℃、5%co2、饱和湿度的恒温培养箱中培养。待细胞达80%～90%融合状态时用0.25%胰蛋白酶消化后传代。实验期间不断冻存细胞，实验时取指数生长期细胞。 　　2.2 细胞生长情况测定 　　细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用dmem培养液调细胞浓度为104个/l，每孔90 μl接种于96孔培养板内，分别加入10 μl 31.25， 62.5，125， 250， 500，1 000 μg/ml 的秦艽总苷，设6个复孔。并设立加104 μmol/l的龙胆苦苷对照组，加pbs的阴性对照组。培养24， 48， 72 h后加入5 mg/ml的mtt 20 μl继续培养4h，吸弃孔内培养液后每孔加入dmso 100 μl,使结晶充分溶解，酶标仪测其吸光度，波长550 nm。细胞生长抑制率（%）=（1-药物组吸光度/阴性对照组吸光度）×100%。 　　2.3 流式细胞仪测定 　　smmc-7721细胞凋亡情况用上述方法将细胞浓度调为105/l，每孔2 700 μl接种于6孔培养板内，分别加入300 μl的1， 5，10 mg/ml的秦艽总苷，设立3个复孔，并设立加104 μmol/l的龙胆苦苷为阳性对照组，加pbs为阴性对照组。继续培养48 h后，吸弃孔内培养液，收集细胞，离心，用pbs洗2次，加入500 μl的binding buffer悬浮细胞，加入5 μl annexin v-fitc混匀后，加入5 μl propidium iodide, 混匀,室温、避光、反应15 min后在上机检测细胞凋亡。 　　2.4 瑞-姬氏染色观察 　　细胞形态将盖玻片置于六孔板内，分别2 700 μl 106个/l的细胞悬液，加入1 000 μg/ml 的秦艽总苷300 μl, 并设立阴性对照组，继续培养48 h，吸弃孔内培养液，取出盖玻片平置于染色架上，滴加复合染液3～4滴，使其迅速盖满盖玻片，染色1 min后滴加缓冲液6～10滴，轻摇玻片，使其充分混合，5～7 min后自来水冲去染液，待干后于光学显微镜检查。 　　2.5 统计学处理 　　采用spss 15.0进行数据处理。 　　3 结果 　　3.1 秦艽总苷对smmc-7721细胞增殖的影响 　　结果见表1。由表1可见，秦艽总苷浓度为31.25，62.5 μg/ml时无抑制作用，而在125， 250， 500，1 000 μg/ml时有一定的抑制作用，其抑制率随浓度和时间而呈上升趋势（plt;0.05），与同浓度的