结肠癌肿瘤自身抗体谱筛选及其应用的论文.docVIP

　　结肠癌肿瘤自身抗体谱筛选及其应用的论文 【摘要】 目的 本研究拟寻找鉴定结肠癌自身抗体谱，研究这些自身抗体作为结肠癌诊断候选血清标志物的可能性，同时鉴定这些自身抗体的抗原为研究结肠癌发生、发展相关的基因提供线索。方法 用结肠癌组织建立了库容量达5×105pfu的cdna表达文库，用结肠癌患者血清进行了文库血清学分析（serex），筛选获得了阳性抗原克隆，进一步分析了其中4个克隆与30例结肠癌和30例正常人血清的反应情况。结果 获得的33个阳性克隆中，31个剪切成功，2个克隆与已知est序列明显无同源性，另外29个克隆与已知基因高度同源。uracildna glycosylase等4个抗原克隆与结肠癌患者和正常人血清反应阳性率分别为76%（23%）、80%（6%）、77%（0）、73%（66%）。结论 本研究发现的29个结肠癌抗原可能参与了结肠癌的发生发展，可能作为结肠癌的治疗潜在分子靶点和结肠癌诊断新的??选血清学标志物。uracildna glycosylase等3个克隆与结肠癌患者血清的反应阳性率明显高于正常人的血清，其相关自身抗体可作为结肠癌诊断的血清标志物。 【关键词】 结肠癌 肿瘤抗原 自身抗体 cdna表达文库 血清标志物 结肠癌是在欧美国家发病率位居第二的癌症，在我国结肠癌的发病率目前排第五位。近年来，其发病率还在逐年上升。目前早期结肠癌的诊断率仍很低，约1/4的患者在初次确诊时已有远处转移，其中50%是肝转移。.最新的肿瘤免疫学研究认为，病人可对自身肿瘤抗原产生体液免疫应答[1]。正常细胞向癌细胞转化过程中，突变的基因或各种异常表达的蛋白可以成为肿瘤抗原诱导机体的免疫反应，在肿瘤患者血清中可以检测到肿瘤相关抗原的自身抗体谱[2]。进一步的研究发现在肿瘤患者和正常人的血清中肿瘤自身抗体谱存在显著差异[3]，提示自身抗体谱有可能作为肿瘤早期诊断的新型血清标志物。基于这个理论，我们构建患者结肠癌组织的cdna表达文库，筛选了结肠癌相关自身抗体谱，并探讨将其作为结肠癌早诊的血清学标志物的可能。 1 资料和方法 1.1 资料 结肠癌组织来自中国医学科学院肿瘤医院收治的1例男性结肠癌患者，病理诊断为低分化型腺癌，肝多发转移，淋巴结转移6/18，为本院腹部外科手术切除，手术同时取该病人血清。其他30例结肠癌术前病人血清来自本院检验科。手术获取的癌组织和患者血清及30例健康正常自愿者的血清采集后立即冻于-80℃备用。 1.2 方法 1.2.1 结肠癌组织mrna的提取 取结肠癌组织500mg，照mrna提取试剂盒mrna polyattract system 1000的说明书进行。提取mrna溶于无rnase去离子水，测a260/280值，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。取6μg mrna用于cdna文库的构建。 1.2.2 cdna表达文库的构建 cdna表达文库的构建使用stratagene公司提供的zapcdna library construction kit。 第一链cdna合成使用thermoscript rt 高温逆转录酶（invitrogen），其余参照建库试剂盒说明书进行。文库4℃保存，筛选之前不扩增。 1.2.3 大肠杆菌/噬菌体裂解液与brsepharose 4b柱料的偶联 取600μl大肠杆菌液加入7×103pfu的λzap空载噬菌体，37℃孵育15min后加入8ml nzy/琼脂糖顶层胶，混匀后铺于18cm直径的含有nzy/agar底层胶的平板上，37℃扩增培养过夜。然后于平板中加入10ml偶联缓冲液（0.1mol/l nahco3, ph8.3），4℃振荡洗脱16h。收集洗脱液，超声破碎未完全裂解的大肠杆菌。经紫外分光光度法进行蛋白定量。偶联的过程基本按照amersham公司提供的说明书进行。偶联后用含有0.02%叠氮钠的tbs平衡凝胶介质，4℃保存待用。 1.2.4 血清标本的吸收 患者血清对文库进行免疫学筛选之前或用阳性克隆与异体血清反应前，必须排除血清中存在的与细菌和噬菌体反应的抗体。采用上述偶联的brsepharose 4b柱料对血清进行预吸收。去除血清中与大肠杆菌/噬菌体蛋白反应的抗体成分。用含有1% bsa的1×tbs 1∶10稀释血清后，按照1∶1的体积比与偶联了大肠杆菌/噬菌体裂解蛋白的柱料混合，4℃轻度振荡过夜，收集血清。血清重复吸收3次。收集吸收后的血清，用含有1%bsa的1×tbs以最终1∶50的稀释度稀释血清，加入0.02%的叠氮钠防腐，4℃保存备用。 1.2.5 cdna文库的筛选 取600μl xl1bluemrf菌液加入7×103pfu的重组噬菌体，37℃孵育15min后加入8ml nzy/琼脂糖顶层胶，混合后铺于18cm直径的含有n