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WesternBlot相关技术操作与原理
中国试剂网 3.11.6.7
Western Blot 相关技术操作与原理
【实验原理】： Western Blot 印迹方法，又称为免疫印记，是将获得的蛋白
质样品通
过 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，对不同分子量的蛋白质进行分离，并通过转
移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物（NC 膜或 PVDF 膜）
上，用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性
结合，再与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合，最后用 ECL 超敏
发光液试剂检测。如果转印膜上含有靶蛋白，经 X 光片曝光、 显影后，
则会在 X-光片上出现特异性蛋白条带。
Western blot 实验分为三个部分：
1． 样品蛋白质的制备、 蛋白质含量测定 2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
3． 凝胶转膜及其检测
以提取细胞蛋白为例 Western 印记杂交实验流程图：
提取细胞总蛋白、测定含量
↓
制备 SDS胶
↓
蛋白样品变性、电泳
↓
电泳转膜
↓
封闭
↓
一抗
↓
TBST 洗涤
↓
HRP 标记的二抗
↓
中国试剂网 3.11.6.7
TBST 洗涤
↓
ECL 试剂作用
↓
X-光片曝光、显影
↓
结果分析
细胞总蛋白的提取及含量测定
一、细胞总蛋白的提取
提取细胞蛋白多是利用将细胞裂解、破碎、使蛋白质释放的??理。提取
蛋白质的方法很
多。其目的都是要获取高丰度、高品质的蛋白质,以满足实验需要。
在提取蛋白质实验中要特别考虑到细胞裂解液的 pH、去污剂的类型和浓
度以及二价阳
离子、辅助因子等因素，同时为防止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解，需在
裂解液中加入蛋白
酶抑制剂。蛋白酶抑制剂的种类很多，如 PMSF(苯甲基磺酰氟)；金属蛋白
酶抑制剂乙二胺
四乙酸（EDTA）、乙二醇双四乙酸（EGTA）；肽蛋白酶抑制剂：亮抑酶肽
（leupeptin）、胃蛋白酶抑制剂 A（pepstatin A）、抑蛋白酶肽（aprotinin）；
甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（TLCK）、
甲苯磺酰丙氨酰氯甲酮（TPCK）等，要根据具体情况具体选择
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