免疫印迹杂交.docxVIP

免疫印迹杂交（Western blot）（050302A） 1．仪器 （1）制胶模具 （2）跑胶及转膜装置 （3）大小玻板 （4）电泳电源 （5）电磁炉 2．试剂： （1）Tris base、 （2）SDS （3）BSA（购自Biotech） （4）Bis-acrylamide（亚甲双丙烯酰胺） （5）Acrylamide（丙烯酰胺） （6）Glycine （7）DTT （8）NaCl（购自BBI） （9）APS（购自Amresco） （10）Tween-20（温州清明化工厂） 3．溶液配制： （1）4 × sample Buffer 终浓度Stock液10 ml 工作液0.25 M Tris-HCl, pH 6.82.5 M1 ml8 % SDS20 ％4 ml0.2 M DTT1 M2 ml30 % glycerol100 ％3 ml少量的溴酚兰 1 ml／管分装，-20 ℃保存。 4 ?上样缓冲液 0.5 mol/L Tris-HCl (PH 6.8) 2.5 ml 1 mol/L DTT 1 ml 甘油 1.5 ml SDS 400 mg 溴酚蓝 5 mg 混匀后-20?C贮存备用。 （2）30%储备胶溶液 丙烯酰胺（Acr） 29.2 g 亚甲双丙烯酰胺 0.8 g 混匀后加ddH2O2，37 ?C溶解，定容至100 ml，棕色瓶存于4?C。 （3）分离胶缓冲液1.5 M Tris-HCL (pH 8.8) 18.15 g Tris溶于适量的ddH2O2, 用HCL调节pH 8.8，定容至100ml，4?C保存。 （4）浓缩胶缓冲液0.5M Tris-HCL(pH6.8) 6.05g Tris溶于适量的ddH2O2, 用HCL调节pH 6.8，定容至100ml，4?C保存。 （5）10% SDS 称取10 g SDS，加入双蒸水并定容至100 ml，搅拌过夜，置于室温防止析出。 （6）10% APS 称取0.2 g APS，加蒸馏水2 ml，-20?C保存。 （7）电泳缓冲液 (Running Buffer，5 ?) Tris 15 g SDS 5 g Glycine 72 g 调节pH 8.3，定容至1 L 临用时用双蒸水稀释成1×，可重复使用3-4次（可根据电泳的速度决定下次是否使用）。 （8）转移缓冲液 (Transfer Buffer，5 ? ) Tris 15.15 g Glycine 72 g SDS 2.5 g 调节pH 8.1~8.5，定容至1 L，临用时双蒸水稀释，800 ml 1×的转移缓冲液加200 ml甲醇 （9）TBST缓冲液（10×） Tris·HCl (pH 7.6) 30.28 g NaCl 80.15 g Tween-20 10 ml 定容至1 L，临用时双蒸水稀释成1×，可重复使用2-3次。 （10）封闭液1 0.5 mg BSA溶于10 ml 1? TBST中，搅拌均匀。 （11）封闭液2 10 g 脱脂奶粉溶于 100 ml的1×TBST （12）叠氮钠存储液 （13）一抗稀释液 4．上样前准备： （1）稀释样本 － 确定要加的每孔样本体积（?l）及上样量（?g） － 计算样本需要稀释的终浓度 － 确定每个样本需要稀释的总体积（?l），4×上样缓冲液的体积为 总体积/4（?l） － 根据已经测定好的蛋白浓度计算需要的蛋白量（?l） － 总体积－蛋白量－4×上样缓冲液＝需要加的ddH2O － 以下表为例 样本编号蛋白浓度样本量4×sampleddH2O体积终浓度加样量加样本量　（ug/ul）?l?l?l?l（?g/ul）?l?gA15.03 14.91 7.57.59 302.50 1230A26.62 6.04 45