实验4_琼脂糖凝胶电泳检测DNA_2010.ppt

实验四 琼脂糖凝胶电泳检测DNA;一、实验目的;二、实验原理;琼脂糖凝胶电泳;质粒DNA分子有三种构型: CC DNA(共价闭合环状DNA:两条核苷酸链均保持着完整的环形结构，DNA呈现超螺旋 )、 OC DNA(开环DNA： 质粒的一条链断裂) L DNA (线形DNA： 质粒的两条链均断裂)， \ 这三种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的泳动率不同，因此电泳后呈三条带，CC DNA泳动最快，其次是LDNA，最慢的是OCDNA ;EB：即溴化乙锭，它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10ng 的DNA 注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套;线性DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系;聚丙烯酰胺凝胶电泳;在pH值为8.0-8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 ;三、仪器、材料与试剂;四、实验步骤;5. 用移液器吸取质粒样品5μl于封口膜上，再加入1μl 的6×加样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔 (记录电样的顺序和电样量) 6. 打开电源开关，调节电压至3～5V/cm，可见溴酚蓝条带由负极向正极移动 (注意DNA片段从负极向正极移动) 7. 当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿1～2cm处，停止电泳 8. 将凝胶置于紫外线透射仪上，打开紫外灯，DNA存在处显出桔红色荧光条带（注意：紫外线对眼睛有伤害作用，应戴上防护眼睛）;;每班4组，约30人 每组7人：1套琼脂糖凝胶电泳系统（电泳槽、电泳仪、制胶板、有机玻璃槽、8孔梳子），20μL或10μL移液枪1支，冰盒1个，50mL锥形瓶1个（贴上EB标签）。 每班配2台电炉，线手套2副。;;五、思考题;;;;1 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否则温度太高会使制板变形 2 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔 3 点样时枪头下伸，点样孔内不能有??泡，缓冲液不要太多 4 EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔 5 紫外线照射不要太久;凝胶电泳槽;