实验一二三四_DNA重组技术.ppt

质粒提取; 碱裂解法小量制备质粒DNA;一．实验目的及背景;质粒的应用;本实验目的;分离质粒DNA方法; 1. 溶菌酶 2. 碱裂解： SDS, NaOH pH 12.0-12.5 3. 中和： pH 4.8 醋酸钠 ;碱变性法基本原理;实验方法; ;注意事项;ＤＮＡ的酶切;一．实验目的及背景;限制酶;Ⅱ型酶;酶切反应注意事项：;２．ＤＮＡ：;３．反应缓冲液：;４．酶解温度与时间：; 质粒 5-8μl 10? buffer 1.5 μl 15μl体系中 E1 0.25 μl E2 0.25 μl ddH2O： 5-8 μl; ;琼脂糖凝胶电泳;琼脂糖凝胶电泳;琼脂糖凝胶电泳;注意事项 合适的凝胶浓度 正确的电泳方向;胶回收;核酸的体外连接;1、DNA连接酶用量与DNA片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100倍。 2、在连接带有粘性末端的DNA片段时，DNA浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入DNA浓度至100-200mg/ml。 3、连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。 4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。 5、在连接反应中，如不对载体分子进行去5‘磷酸基处理，使用过量的外源DNA片段（2-5倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA和载体连接的机会。 ; 大肠杆菌感受态细胞 的制备和转化  ;一．实验目的及背景;;实验原理;;;材料、试剂及器具 1、? 材料 E.coli DH5α 转化产物 2、? 试剂 （1）0.1mol/L CaCl 2（灭菌）。 （2）LB液体培养基、固体培养基。 （3）氨苄青霉素（Amp）：用无菌水配制成100mg/mL溶液，置 -20℃冰箱保存。;;?;4000rpm，离心10min回收细胞↓用冰冷的0.1mol/L CaCl 2 1mL，悬浮沉淀↓立即放在冰上保温30min↓4℃，4000rpm，离心10min，回收细胞↓用冰冷的0.1mol/L CaCl 2 0.1mL悬浮细胞（务必放冰上）↓分装细胞，每100μl一份。此细胞为感受态细胞;质粒/连接产物的转化 在100μl新鲜配制的感受态细胞中加入连接产物，↓ 冰上放置30min ↓ 将管放到42℃循环水浴热冲击90s ↓ 取出，迅速冰浴2min ↓ 每管加400μl LB液体培养基，37℃慢摇复苏40min; ↓ 3000rpm，离心5min回收细胞 ↓ 吸弃450 μl 上清后，轻轻重悬细胞，全部铺平板，待菌液干燥后倒置培养皿，于37℃培养过夜 ↓ 次日观察，并记录转化情况，计算转化率（转化子数/μgDNA）。;