CDR3导向抗体库法人源化抗膀胱癌Fab的鉴定的论文.docVIP

　　CDR3导向抗体库法人源化抗膀胱癌Fab的鉴定的论文 【摘要】 　　目的: 对通过cdr3导向抗体库法筛选到的3株人源化膀胱癌噬菌体抗体进行进一步分析鉴定。方法: 用elisa方法对筛选特异性克隆进行特异性鉴定、 抗原表位的核实; 采用硫氰酸盐洗脱elisa法评估其亲和力; 选用活性较高的克隆进行膀胱癌组织的免疫组化实验。结果: 3株阳性克隆可溶性表达后能够与膀胱癌ej细胞特异性结合; 与鼠源噬菌体抗体(bdi)相比, 2株克隆的亲和指数比较低, 均为0.25 mol/l, 1株克隆的亲和指数为0.7 mol/l, 略低于鼠源的亲和指数（0.9 mol/l）的水平。选择活性较高的克隆进行膀胱癌组织的免疫组化实验, 显示该克隆能够与癌组织特异性结合。结论: 用cdr3导向库法获得的人源抗体片段基本保持了原鼠源单克隆抗体(mab)bdi的特性。 【关键词】 抗膀胱癌单克隆抗体 噬菌体抗体库 鼠单克隆抗体人源化 　　单克隆抗体(mab)在许多领域得到极为广泛的应用, 但由于其鼠源性, 限制了在临床治疗方面的应用, 近几年由于人源化和人源抗体研制技术的进展才得以迅速发展。目前, 对鼠mab进行人源化改造有多种方案。以噬菌体抗体库技术为基础的“抗原表位定向选择法” 是近年来发展起来的一种鼠mab人源化新方法［1, 2］。该方法通过鼠-人轻重链可变区杂合配对, 用抗原进行亲和筛选, 最终得到与亲本鼠mab识别相同抗原表位的人源抗体。.该方法能够确保所筛选到的抗体为人源抗体, 不含鼠源序列。但所获人源mab的特异性及亲和力难以得到保证, 有时所获人源抗体与抗原的结合活性会产生漂移, 与亲本鼠mab有所不同。cdr3导向抗体库法是在“抗原表位定向选择法”的基础上尝试的一种新方法。该方法通过构建含鼠mab cdr3区基因的人源抗体库, 并利用cre-loxp定位重组系统构建大容量抗体库, 直接筛选与亲本鼠mab特异性相同的人源抗体。运用该方法我们尝试人源化抗膀胱癌鼠mab bdi, 获得3株人源噬菌体抗体fab基因, 并证实筛选到的克隆与亲本鼠mab识别相同的抗原表位［3］。本研究中, 我们将对其特性作进一步分析鉴定。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 抗膀胱癌噬菌体抗体由本室运用cdr3导向抗体库法筛选获得, 抗膀胱癌人-鼠嵌合抗体（cbdi）、 抗乙肝表面抗原fab (hbsag fab)、 大肠杆菌菌株、 vcsm13、 l929细胞由本室制备保存［4］; 抗膀胱癌鼠mab (bdi)、 膀胱癌细胞株（ej）由北京大学医学部泌尿研究所俞莉章教授提供; 限制性内切酶为takara公司产品; 各种酶标抗体购自promega公司和sigma公司。 　　1.2 方法 　　1.2.1 可溶性fab抗体的表达及检测 参照文献［5］介绍的方法构建和表达可溶性fab抗体, 并按照文献［6］介绍的方法接种膀胱癌ej细胞及l929细胞于96孔板, 以hrp-羊抗人fab为二抗, 检测上清中人fab与膀胱癌细胞的结合活性及特异性。 　　1.2.2 相对亲和力的测定 （1）测定硫氰酸铵(nh4s)对ej细胞抗原的影响: 接种ej细胞于96孔板培养过夜, 用2.5 ml/l戊二醛或丙酮/无水乙醇（1∶1）固定细胞, 30 g/l的脱脂牛奶-pbs（mpbs）37℃封闭1 h, 加入不同浓度（0～2.0 mol/l）的nh4s, 室温静置15 min, pbs洗3次, 加入相同浓度的鼠mab (bdi)和嵌合抗体（cbdi）, 50 μl/孔, 37℃孵育1 h, 0.5 ml/l tab fab噬菌体上清50 μl/孔, 37℃孵育1 h, 0.5 ml/l tin, pbs洗3次, 加入hrp-抗m13（1∶5 000）37℃孵育2 h, 再经洗涤后opd显色, a490计数。抗体与抗原结合的a490值在经洗脱后下降至50%的nh4s浓度即为该抗体的亲和指数, 以mol/l表示［7］。 　　1.2.3 免疫组化实验 取临床病理确定的膀胱癌标本的石蜡切片脱蜡后, 蒸馏水洗涤5 min×3次, 将切片放入盛有枸橼酸盐的缓冲液（ph6.0）的容器中, 置微波炉内加热, 在92℃～95℃之间持续10～15 min, 室温冷却10～20 min。蒸馏水冲洗, pbs浸泡5 min。50 g/l山羊血清封闭1 h, 加入待测的抗体, 4℃冰箱放置过夜。次日, pbs冲洗5 min×3次, 加hrp-抗m13或hrp-羊抗人fab, 室温放置2 h, 继续pbs冲洗5 min×3次, 加入dab显色, 复染, 封片。 　　2 结果 　　2.1 可溶性fab抗体的表达及检测 将获得的3株人源抗膀胱癌噬菌体抗体以nhe i酶切, 除去噬菌体抗体表达载体中的基因ⅲ片段,