流式细胞仪的荧光补偿问题_1.pptVIP

流式细胞仪的荧光补偿问题 河南大学第一附属医院检验科 Laboratory of the first hospital affiliated to Henan University 1.荧光素为什么会出现荧光？ 2.检测前为什么需要进行荧光补偿？ 3.荧光补偿的方法有哪些？ 4.荧光补偿的原则是什么？ 荧光发生的机理 室温下荧光素分子大部分处于“基态”，当荧光素在一定波长（激发波长）的光的照射下吸收光能后（经染色后的细胞在激光束的照射下），荧光染料吸收能量能级跃迁，进入新的状态，称为“激发态”，处于激发态的分子极不稳定，它可以通过在10-9－10-7秒的极短时间内以发射一定波长的光量子的方式释放所吸收的能量从而返回到基态。这一过程称为荧光发射，也就是发光。 荧光素的激发光谱和发射光谱 任何发荧光的物质分子都具有这两个特征光谱 激发光谱（Excitation，Ex）： 是指能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的光线，也称为吸收光谱。 吸收波峰（最大吸收波长）：Ex-Max 发射光谱（Emission）： 是指某一波长激发光引起荧光素发射的一定波长范围内的荧光。 发射波峰（最大发射波长）：Em-Max 发射波峰--最大发射波长 FITC--异硫氰酸荧光素 PE--藻红蛋白 PE-Cy5--藻红蛋白偶联物 荧光染色对照的设置 阴性对照 空白对照（自发荧光） 同型（ISO)对照（自发荧光＋非特异荧光） 实验样本（特异荧光＋自发荧光＋非特异荧光） 荧光染料平均荧光强度比较 PerCP APC FITC ECD PC5 PE 同型对照的选择 与实验染色的单克隆抗体特异性无关的免疫球蛋白亚型； 与染色的单克隆抗体 ①相同种属来源 ②相同免疫球蛋白及亚型 ③相同荧光素标记 ④相同剂量和浓度 分析类型 管 功能 加入的抗体 单色分析 1 Isotype γ1-FITC 2 Sample1,2…… A-FITC 双色分析 1 Isotype γ1-FITC γ2a-PE 2 Compensation1 A-FITC γ2a-PE 3 Compensation2 γ1-FITC B-PE 4 Sample1,2…… A-FITC B-PE 三色分析 1 Isotype γ1-FITC γ2a-PE γ1-PC5 2 Compensation1 A-FITC γ2a-PE γ1- PC5 3 Compensation2 γ1-FITC B-PE γ1- PC5 4 Compensation3 γ1-FITC γ2a-PE C-PC5 5 Sample1,2…… A-FITC B-PE C-PC5 四色分析 1 Isotype γ1-FITC γ2a-PE γ1-ECD γ1- PC5 2 Compensation1 A-FITC γ2a-PE γ1- ECD γ1- PC5 3 Compensation2 γ1-FITC B-PE γ1- ECD γ1- PC5 4 Compensation3 γ1-FITC γ2a-PE C- ECD γ1- PC5 5 Compensation4 γ1-FITC γ2a-PE γ1- ECD D-PC5 6 Sample1,2…… A-FITC B-PE C-ECD D-PC5 荧光补偿（compensation） 定义：指在流式细胞多色分析中，纠正荧光素发射光谱重叠（spectral overlap）的过程，即从一个被检测的荧光信号中去除任何其他的干扰荧光信号。 补偿方法 手动补偿 自动补偿（flow-set) 无论手动或自动补偿都需将单种荧光素标记的单克隆抗体分别进行单色荧光染色 ※即几色分析就需要制备几个补偿对照管 现举例进行FITC、PE、PC5三色手动补偿 1.准备ISO（阴性对照管）； IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PC5 2.通过调节电压，使阴性群体落在双阴性区域； FITC与PE、FITC与PC5、PE与PC5 FITC FITC与PE PE 3.上单染管(CD3-PC5、CD4-FITC、CD8-PE)，准备补偿； （注：保持电压绝对不变；开始补偿前，将原补偿全部归零；） 调节补偿原则 横平竖直 即X-mean或Y-mean相等 双色荧 光补偿1 双色荧 光补偿2 双阴 双阳 单阳 CD3-CD4-CD8- CD3-CD4+CD8+ CD3+CD4+CD8-CD3+CD4-CD8+ 前T细胞 胸腺皮质细胞 胸腺髓质细胞 外周血 恳请各位老师指正！