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以直接計數法進行總菌數測定 (血球計數器) 組長: 蔡傑舟 4980N020 組員: 李俊澄 4980N052 陳凱傑 4980N075 黃瑋晟 4980N031 指導老師:曹俊文 一、目的: 了解直接計數法測定總菌數的原理及方法。 二、原理 總菌數測定是計算微生物的直接方法，可分為直接計數及間接計數二類。其中直接計數是利用不同的計數器或載玻片（有界線或一般載玻片）在顯微鏡下直接觀察，計算微生物細胞的總數量。此方法優點為方便、快速、節省時間；缺點是無法辨識是否為微生物或只是玻片上看不清楚的黑影，部分微生物未能沉降或為死亡狀態，以肉眼觀察計數的誤差極大。直接計數的目的為計數並非觀察，所以只需能辨別出菌體即可。 以下介紹直接計數的三種方法： 血球計數器為直接計數法中最常用的方法，計數器上凹槽有一邊長1mm的正方形格子，該格內分為25個大方格（5*5），每一大方格再細分16小方格（4*4），因此每小方格的邊長為0.05。在高度方面蓋上蓋玻片後，玻片與計數器的間距恰好為0.1，故每小格的體積0.00025。 實驗時滴入菌液蓋上蓋玻片，使菌液充滿計數器凹槽中，接著以顯微鏡觀察計算小方格內菌體數量，即可求得單位體積樣品之總菌數。 (二) 有界線載玻片是在載玻片的表面上刻有間隔1mm的平行線，其實驗首先以滴管吸取0.05ml的待測水樣，滴於載玻片上並蓋上蓋玻片。接著計算（共進行2 ~ 5次）在顯微鏡上放大100倍時，沿線條出現每種微生物的個數。若有群體出現的微生物，每個相連的群體當成一個個體計算。 　　(三) 廢（汙）水處理場或汙染現場（on-site）其設備及操作條件較實驗室差，不一定能以上述方法進行計數，有時為了快速地推估微生物數量，可利用簡略方法，即於光學顯微鏡放置一般載玻片進行觀察計數。唯進行時，應將佈滿整個蓋玻片的微生物全部計數，並重複2~3次。此法因載玻片上無格線或標示，很容易計算錯誤。 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　　　 　　　　　　　　 三、實驗材料及儀器 1.試管 2.試管架 3.玻璃吸管 4.吸球 5.稱藥紙 6.稱藥勺7.酵母菌 8.培養液 9.塑膠滴管 10.蓋玻片 11.燒杯 儀器: 1.電子天平 2.光學顯微鏡 3.血球計數器 4. UV-vis光譜儀 四、實驗步驟 1. 取0.5ｇ酵母粉加於50ml培養液中，均勻搖晃。 2. 將酵母菌液進行連續10倍稀釋，有2種實驗過程。 (1)測吸光值 a.利用UV-vis spectrophotormeter測菌液吸光值波長調至 595nm。 b.光譜儀內有2個凹槽，先以培養液裝2個比色管至八分滿，進行校正歸零。 c.將外側比色管取出，加入菌液八分滿測吸光值，從低往高濃度方向測。 d.吸光值最好介於2 ~ 0.01之間，如果未介於應捨棄不用。 (2) 血球計數器算菌數 a.以血球計數器算菌數，吸取稀釋好之菌液，滴於血球計數器之中央再蓋上專用蓋玻片。 b. 以顯微鏡觀察計算菌數。 c.每小格體積為0.00025，16格則有 0.00025*16=0.004=0.000004cm3。 d.換算成菌液菌數(菌/ml)。 五、結果與討論 吸光值與菌數 稀釋倍數吸光值菌數(個/ml)10^-10.65129/5=5.8 5.8/(4*10^6)=145000010^-20.05718/5=3.6 3.6/(4*10^6)=90000010^-30.0174/5=0.8 0.8/(4*10^6)=20000010^-40.0142/5=0.4 0.4/(4*10^6)=10000010^-50.0131/5=0.2 0.2/(4*10^6)=5000010^-60.012010^-70.011010^-80.010010^-90.0010 1.說明以直接計數法（血球計數器）進行微生物計數之原理與優缺點為何？ 計數器上凹槽有一邊長1mm的正方形格子，該格內分為25個大方格（5*5），每一大方格再細分16小方格（4*4），因此每小方格的邊長為0.05。在高度方面蓋上蓋玻片後，玻片與計數器的間距恰好為0.1，故每小格的體積0.00025。實驗時滴入菌液蓋上蓋玻片，使菌液充滿計數器凹槽中，接著以顯微鏡觀察計算小方格內菌體數量，即可求得單位體積樣品之總菌數。 優點：方便、快速、節省時間。 缺點：無法辨識微生物是否為微生物或只是玻片上看不清楚的黑影，部分微生物未能沉降或為死亡狀態，以肉眼觀察計數的誤差極大。 2.計數時，若小格格線上有微生物，為何不計每小格線左方與上方之微生物，謹計小