流式细胞仪检测凋亡和细胞周期等应用教程.pptVIP

流式细胞术 Flow Cytometry;什么是流式细胞仪; 1. 发展历史 1934 Moldavan 1973 Steinkamp ;2. 定义：对在高速流动的鞘液包括下对特异荧光标记的细胞、粒子进行分析和分选的技术. 3. 特点 测量速度快，每秒钟能测数千个乃至上万个细胞 可进行多参数测量 在分析的同时可把具有指定特征的细胞分离出来，即分选技术。 ; 凡是能被荧光素标记的细胞或颗粒都可用流式细胞仪检测。 前提这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发 在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的一机多用的仪器。 ;二、流式细胞仪的工作原理和基本结构;;基本结构;三、 流式细胞仪可检测到的细胞参数;血液涂片;外周全血细胞散射光双参数点图;荧光信号;荧光信号与细胞特性;二色镜 1 2 3;三 数据处理及流式报告;流式报告的图一般分为四种，即散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为散点图和直方图。 几个概念： %Gated：阳性细胞百分比。反映细胞群体中阳性细胞的数量。 Mean：平均荧光强度，与被检测物质的表达量有关，在正态分布时一般用该值。 Geo Mean：几何平均荧光强度，在阳性细胞为偏态分布时一般用该值。;散点图 ;图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死;流式细胞仪数据分析;流式细胞仪数据分析;图中100～101（M1）为阴性细胞，101以上的（M2）为阳性细胞 ; 五、 流式细胞术的应用;一） 细胞DNA含量检测;;单参数直方图;DNA细胞周期分析;2倍体;含量与凋亡关系;二）肿瘤诊断与抗肿瘤药物研究 ;1. 肿瘤诊断;2倍体;2. 凋亡研究;Annexin V Assay;图 Annexin V/PI双标记分析细胞凋亡和坏死;Date acquired: 14-Jan-03 File: 7Gy 4hr.001 Source: dongbo DIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M: 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04 Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48 ;根据凋亡细胞的特点来检测; CD3(T细胞，CD4、CD8))、CD19（B细胞）、CD16、CD56（NK细胞），原发性或继发性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴细胞增殖病、肿瘤疗效观察与预后判断、移植免疫检测等。 ;;;流式细胞术检测细胞表型 ; 流式细胞术白血病免疫分型是利用荧光素标???的单克隆抗体作分子探针，多参数分析白血病细胞的免疫表型，了解被测白血病细胞所属细胞系列及其分化程度。 FCM分析白血病免疫表型, 快速、特异、准确，重复性好，能区分细胞起源、划分其分化发育阶段等，对白血病的诊断与分型、治疗方案选择与预后判断、发病机理研究等有重要价值。 ; 五） 细胞内蛋白的分析：;荧光信号;荧光样本制备; 端粒（荧光蛋白）;　　 六）细胞内钙离子测定 1×106/ml的细胞悬液， 加入终浓度为1-5μmol/ml Fluo-3/AM，充分混匀，室温避光作用60分钟。 以HEPES缓冲的Hank’s平衡盐溶液洗三次，重悬于0.5ml同样的溶液，上流式细胞仪检测。 根据报告中给出的样品荧光强度计算细胞内钙离子的浓度。;FCM检测胞内钙离子、 膜电位和线粒体功能 ;M1阴性界限划分完全是根据阴性对照！如下图：红色部分代表阴性对照，即：所检测的物质在阴性组中的基础表达量，可以理解为背景、静息状态下、基础水平、未受刺激时等。蓝色部分即阳性组，也就是接受刺激后，功能状态下、药物作用后等。; 六. 分选：;488 nm laser;对比-----流式细胞仪是一种特殊的显微镜;流式细胞仪;谢 谢 大 家