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对大肠杆菌 DAPI 染色方法的改进 杨丽 （北京理工大学生命学院，北京 100081） 摘要：目的，改进以大肠杆菌为代表的细菌类 DAPI 染色方法；方法，用传统染色方法和我 们摸索出来的染色方法对两种大肠杆菌细胞进行染色，并进行激光共聚焦显微镜观察。结果， 改进后的方法使大肠杆菌的染色效果得到明显优化；结论，尽管该方法相对复杂，但是适合 于对大肠杆菌进行 DAPI 染色，从而定位核区在菌体内的位置。 关键词： DAPI；大肠杆菌；染色 中图分类号：Q503/Q934 Improvement of E.coli DAPI staining method Yang Li (School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081) Abstract: Purpose: Improve the method for DAPI staining in different kinds of bacteria with E.coli as a represent; Method: Stain two types of E. coli cells using conventional method and developed method, and compare the results of these two stain method by confocal microscope. Result: The improved method is optimized; Conclusion: Although the method is complex, E.coli nuclear could be seen clearly with this staining method. Keywords: DAPI; E.coli; Staining 1 引言 DAPI 是一种针对活细胞染色的 DNA 蓝色荧光染料，和双链 DNA 结合后不改变细胞基 因的超微结构。荧光染料 DAPI，中文名称 4，6-联脒-2-苯基吲哚，能识别双链 DNA 小沟， 特别是 AT 碱基。当它与双链 DNA 结合时，荧光强度增强 20 倍，而与单链 DNA 结合则无 荧光增强现象，没有结合 DNA 的 DAPI 荧光也很弱，结合后的最大激发波长为 364nm，可 用紫外光源进行激发，特异性较溴化乙啶更高。DAPI 优点是标记技术简单，并且标记效率 很高，被标记的细胞能清楚的观察到。缺点是细胞分裂将导致 DAPI 淬灭，仅适于短期分析。 DAPI 染色较常用于细胞凋亡的检测，染色后利用 DAPI 的蓝色荧光使用激光共聚焦显 微镜或流式细胞仪来进行检测。并且也可以将 DAPI 用于各种细胞和菌体的细胞核或核区染 色。如果将 DAPI 用于普通细胞核染色，比较容易达到较为理想的染色效果。但是如果对细 菌类的进行染色，则较容易产生一些问题，例如染色不均匀或菌体被通体染色等状况。这是 因为由于菌体的个体大小一般为几个微米左右，而普通细胞大小在十几到几十微米之间， 由于菌体体积较小，染料通透性相对较差，所以核区不容易被染料着色，或者染色后出现菌 体通体被染料包裹的情况发生，影响观察效果。 对于大肠杆菌这类革兰氏阴性菌的 DAPI 染色方法，目前没有比较固定与系统的染色方 法，只是在许多已经发表的论文上，会涉及到比较粗略的染色过程，但是没有比较详细的染 色步骤。针对以上情况的发生，我们利用大肠杆菌为模型，对细菌类的 DAPI 染色方法与技 巧进行讨论与分析，以期达到较为理想的染色效果。 作者简介：杨丽(1985-),女，硕士研究生，主要研究 DNA 的重组修复方向. E-mail:  HYPERLINK mailto:yangli_bit@ yangli_bit@  2 材料和方法 2.1 实验材料 E.coli JM83 由英国爱丁堡大学 D. Leach 教授惠赠，E.coli ΔrecG265::CmR 突变菌由法国 CNRS B. Michel 教授惠赠。DAPI 购自 Sigma 公司，多聚甲醛、Triton-X100 购自北京拜尔迪 生物技术有限公司，载玻片与盖玻片购自北京凯诺春天科技有限公司。成像系统为德国徕 卡显微系统有限公司的 Leica 激光共聚焦显微镜。 2.2 传统大肠杆菌 DAPI 染色方法 一般情况下，常用的方法是依据细胞的染色方法，进行简单的染色处理，并且不同的实 验室可能有不同的操作方法。在此举出一种简单常用的染色方法。将适量 0.1μg/mL 的 DAPI 直接滴加在菌液上，避光染色处理 1~2 小时[1-5]。 2.3 改进的大肠杆菌 DA