流式细胞技术与其应用.pptVIP

流式细胞技术及其在科研中的应用 ;课程内容; ;§1.1 基本概念;§1.2 技术特点;§1.2 技术特点;; 第二部分 仪器构造及工作原理;§2.1 仪器构造;§2.2 工作原理;液流驱动系统 将待测细胞或微粒进行荧光染色后制成悬液标本，在一定气体压力下将待测样品压入流动室，用不含细胞或微粒的缓冲液（又称鞘液）在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测细胞或微粒流成一定角度，使鞘液包绕着细胞或微粒高速流动，形成一个圆形的流速（即鞘流），待测细胞在鞘液的包裹下单行排列，依次通过流式细胞仪的检测区域。 ;;§2.2 工作原理;;§2.2 工作原理;;§2.2 工作原理;前向角散射光（FSC）;侧向角散射光（SSC）;;;;§2.2 工作原理;　;;§2.3 细胞分选原理;; ;§3.1 荧光探针的选择;常用荧光染料的特性; 异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC） FITC是一种最为常见的荧光探针，其分子量为389Da，用488nm的激光激发后发射荧光的峰值在520nm附近，使用530±15 nm的带通滤光片可得到最佳的荧光检测信号。FL1探测器检测FITC。; 藻红蛋白 ( p-phycoerythrin,PE)PE是在红藻中所发现的一种可进行光合作用的自然荧光色素，分子量为240kD的蛋白，当使用488 nm激光激发时其发射荧光峰值约为576 nm，对于单激光器的流式细胞仪来说，推荐使用585±21nm的带通滤光片，双激光器的流式细胞仪推荐使用575±13nm的带通滤光片。FL2探测器检测PE。; 多甲藻叶绿素蛋白（peridinin chlorophyll protein，PerCP）PerCP是在甲藻和薄甲藻的光学合成器中发现的，是一种蛋白复合物，分子量约为35kD，当被488nm氩离子激光激发后，发射光的峰值约为677nm。FL3探测器检测PerCP。;§3.1 荧光探针的选择;§3.2 免疫荧光染色;§3.4 光谱重叠的补偿;;§3.4 光谱重叠的补偿;§3.4 光谱重叠的补偿;§3.4 光谱重叠的补偿;§3.4 光谱重叠的补偿; 设门（gating）是流式细胞仪分析中的一种重要技术，只有通过最佳的设门方式，才能准确地获取和分析。 “设门” 是指在细胞分布图中，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群。 通过“设门”得到不同的 区域（Region）。从而对其中的细胞进行单参数或多参数分析。 ;§3.5 设门策略;; ;（2）离线设门 又称为非实时设门（non-real time gating）， 是指在流式细胞仪已获取数据后，通过计算机软件将数据调出，设定不同的散射光和（或）荧光信号范围进行数据分析的设门方式。适合于一些需要多重设门并进行较为复杂分析的数据，尤其是对于一些荧光染色强度不定的样本，可以采用较大范围的散射光阈值设门，获取所有信号并储存在计算机硬盘等介质中，再进行离线设门分析，可以更好地保持数据的完整性。;;;§3.5 设门策略;检测范围; 第四部分 应 用;§4.1 免疫表型分析;§4.1.1 样品制备;§4.1.1 样品制备;§4.1.1 样品制备;§4.1.2 抗体选择;§4.1.3 免疫荧光染色;§4.1.4 荧光染色对照的设置;阴性对照 是指用已知不表达某种抗原的细胞作为样本检测，应出现阴性结果的对照实验。阴性对照试验可以避免单克隆抗体的纯度不够或特异性差等因素造成的假阳性结果。;§4.1.4 荧光染色对照的设置;§4.1.4 荧光染色对照的设置;§4.1.6　标本的固定与保存;§4.1.7 免疫表型分析的影响因素;;;;§4.2 细胞周期与DNA倍体分析;§4.2 细胞周期与DNA倍体分析; ;§ 4.2.2 DNA含量的表示方法 ;§4.2.1 DNA倍体的判定标准;1. 单细胞悬液制备 新鲜或新鲜冰冻标本： 白血病标本、穿刺液很容易获得单细胞悬液。实体肿瘤可在含去污剂的缓冲液中手工机械处理，细胞核可释放至悬液中。 新鲜固定的标本： 标本切成1～2mm2的小块，在含胃蛋白酶的0.1mol/L HCl液中孵育或