一例牛病毒性腹泻病例的血清学诊断.docVIP

　　一例牛病毒性腹泻病例的血清学诊断 一例牛病毒性腹泻病例的血清学诊断 　牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus, BVDV）属于黄病毒科，瘟病毒属成员，主要引起牛病毒性腹泻-黏膜病，造成患牛免疫耐受、持续性感染、母牛流产、死胎和畸形胎。20世纪40年代，在加拿大首次发现该.L371328）购自克格仪器有限公司；牛病毒性腹泻抗原ELISA检测(血清) 试剂盒（货号：99-43810）购自北京祥龙环宇生物技术有限公司。 　　2 方法 　　2.1 应用猪瘟胶体金快速检测试纸卡检测牛病毒性腹泻抗体(血清) 　　2.1.1 操作步骤 从30份患牛抗凝血中分离血清，将分离的血清加入到猪瘟胶体金快速检测试纸卡的检测孔内，50ul/孔，放置于室温中15min后，观察反应结果。 　　2.1.2 判定方法 猪瘟胶体金快速检测试纸卡T区（检测线）呈现紫红色，并且C区（对照线）也呈现紫红色时，判定为阳性。当T区不变色，而C区呈现紫红色，则判定为阴性。如果C区不呈现紫红色时，此卡不能使用，为失效检测卡。 　　2.2 应用牛病毒性腹泻抗原ELISA检测试剂盒检测抗体(血清) 　　2.2.1 操作步骤 　　2.2.1.1 编号 将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔，空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同。 　　2.2.1.2 加样 分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50mu;l。然后在待测样品孔先加样品稀释液40mu;l，然后再加待测样品10mu;l。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 　　2.2.1.3 孵育 用封板膜封板后置37℃孵育30min。 　　2.2.1.4 洗涤 小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。 　　2.2.1.5 加酶 每孔加入酶标试剂50mu;l，空白孔除外。孵育同2.2.1.3，洗涤同2.2.1.4。 　　2.2.1.6 显色 每孔先加入显色剂A 50mu;l，再加入显色剂B 50mu;l，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15min。 　　2.2.1.7 终止 每孔加终止液50mu;l，终止反应(此时蓝色立转黄色)。 　　2.2.1.8 测定结果 以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。 测定应在加终止液后15min以内进行。 　　2.2.2 判定方法 　　2.2.2.1 试验有效性 阳性对照孔平均值ge;1.00；阴性对照平均值le;0.10。 　　2.2.2.2 临界值(CUT OFF)计算 临界值=阴性对照孔平均值+0.15。 　　2.2.2.3 阴性判定 样品OD值lt; 临界值(CUT OFF)者为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阴性。 　　2.2.2.4 阳性判定 样品OD值ge; 临界值(CUT OFF)者为牛病毒性腹泻病毒(BVDV)阳性。 　　3 结果 　　用猪瘟胶体金快速检测试纸卡和牛病毒性腹泻抗原ELISA检测试剂盒检测30份患牛血清，牛病毒性腹泻阳性数分别为12份和15份，阳性率分别为40%和50%。两种检测方法对牛病毒性腹泻的检测结果较为相近，但还是略有差异。 　　4 讨论 　　牛病毒性腹泻病毒属于黄病毒科，瘟病毒属成员，是无节段的单一的RNA病毒。因此，如果要开展分子方面检测，也就是RT-PCR检测，在操作过程中需要对基因组RNA进行操作，这就要求整个实验过程中不能混入RNA酶，对检测环境的要求较为严格，导致不能对农村散户进行推广。而牛病毒性腹泻抗原ELISA检测(血清) 试剂盒也需要操作者具备相关的专业技能，除此之外，还需要专业的移液枪和吸头，以及昂贵的酶标仪等仪器，这使基层的养殖户不能直接使用，某种程度会延误对疫病的早期诊断，从而错过对牛病毒性腹泻的最佳治疗时机，最终导致不必要的经济损失，使牛病毒性腹泻病毒的进一步蔓延，不利于对该传染病的防控与净化。 　　虽然，免疫胶体金试纸检测卡使用上特别方便，但截止目前，在牛病毒性腹泻的检测试剂盒中未见有免疫胶体金试纸检测卡的报道，为给基层农村养牛户寻找一种行之有效，并且方便操作的检测手段。本研究根据猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒同属黄病毒科，瘟病毒属成员，并且两者在血清学上存在交叉反应，基于此考虑，我们尝试用猪瘟病毒快速检测试纸卡检测疑似感染牛病毒性腹泻病毒血清，结果显示，猪瘟病毒快速检测试纸卡完全可以用于牛病毒性腹泻的检测，只是检测结果与牛病毒性腹泻抗原ELISA检测(血清) 试剂盒略有差异。至于哪种方法更准确，这需要进行RT-PCR等分子生物学方法来验证。