五加皮多糖对人宫颈癌Hela细胞凋亡作用的研究.docVIP

　　五加皮多糖对人宫颈癌Hela细胞凋亡作用的研究 作者：刘芳 杨翠军 孙黎 刘进军 田嘉铭 薄爱华 戴洁 【摘要】 　　目的观察五加皮多糖对体外培养人宫颈癌细胞hela的凋亡作用。方法苯酚-硫酸法提取五加皮多糖，采用MTT法、DNA琼脂糖凝胶电泳法及流式细胞术检测五加皮多糖对人宫颈癌细胞增殖抑制及凋亡作用。结果经五加皮多糖24，48 h作用后的hela细胞，应用MTT法测出对细胞有明显的抑制作用；经不同浓度五加皮多糖作用的hela细胞电泳均出现相差约200 bp的DNA梯子状条带；流式细胞仪检测后发现，不同浓度五加皮多糖处理hela细胞，细胞增殖受到明显抑制。结论五加皮多糖抑制体外培养的人宫颈癌hela细胞的生长，诱导其细胞凋亡。 【关键词】 五加皮多糖 hela细胞 凋亡 抑制率 　　五加皮为五加科落叶小灌木细柱五加的根皮，常在夏、秋二季采挖，剥取根皮，晒干。其功效为散风祛湿，利水消肿，益肝肾壮筋骨［1］。古医书中也有报道五加皮用于 治疗 骨癌、肝癌、肾癌等肿瘤的记载［2］。且 现代 药理研究还发现红毛五加皮多糖、刺五加皮多糖对肿瘤细胞有明显的抑制作用。本文就五加皮多糖的体外抗肿瘤作用［3，4］，来探讨对人宫颈癌hela细胞的凋亡［5～7］机制，为五加皮多糖的研究和开发探讨新的思路。 　　 1 器材 　　人宫颈癌hela细胞购自北京肿瘤研究所遗传室，后经本院实验中心细胞室传代冻存。五加皮多糖购自河北北方学院中医门诊；琼脂糖、200 bpDNAmaker 为六合通公司产品；碘化丙锭综合染液购自晶美生物工程公司；RNase A，Bovine pancreas为华美生物工程公司；其他均为国产分析纯试剂。美国FACSAria流式细胞仪等。 　　 2 方法 　　2.1 细胞培养 细胞培养用DMEM高糖培养基 ；加入10﹪胎牛血清，庆大霉素100 μl/ml，7.6﹪NaHCO3调至pH 7.4。复苏细胞放置37℃ 5%的CO2培养箱中进行培养。每天更换一次培养基。当细胞生长至对数生长期加五加皮多糖处理。 　　2.2 MTT法取对数生长期的hela细胞，用胰酶消化约4 min，计数密度为5×104/ml的hela细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μl，待细胞贴壁后每孔加入16.8 mg/ml五加皮多糖（0，20，40，60，80，100 μl），共6组，每组4个平行孔，用培养基补至200 μl/孔，五加皮多糖最终浓度分别为0，0.525，1.05，2.1，4.2，8.4 mg/ml。置37℃，体积分数为5﹪CO2条件下分别培养24，48，72 h，加入MTT (浓度5 mg/ml，10 μl/孔)，继续培养4 h后，弃上清液, 每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100 μl，10 min后置酶联免疫检测仪上测各孔光密度(OD)值，波长为492 nm， 计算 平均OD值和抑制率。 　　2.2.1 五加皮多糖制备称取已干燥粉碎的五加皮制成232 g，加入1 000 ml体积分数0.85乙醇回流提取1 h,滤过，滤渣加入1 000 ml三蒸水回流提取2 h,过滤，滤渣再加入1 000 ml三蒸水回流提取2 h,合并两次滤液，减压浓缩至适量，4倍无水乙醇醇沉，静置过夜，过滤，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、石油醚洗涤，即得五加皮多糖。制成16.2 mg/ml的溶液，高压灭菌4℃保存。 　　2.2.2 流式细胞仪分析按上述方法收集细胞，用磷酸缓冲液洗（pH 7.4）3次，7 000 g/min，8 min后去上清，加2 ml缓冲液计数细胞1×106，加入碘化丙啶综合染液1 ml染色30 min，在流式细胞仪上观察细胞周期。 　　2.2.3 DNA琼脂糖凝胶电泳分析取对数生长期细胞6瓶，每瓶共含有1×106个细胞，用细胞培养液把稀释五加皮多糖稀释成不同浓度（0，1.344，2.688，4.032，5.376，6.72 mg/ml），分别加入6个培养瓶中，加培养液至5 ml。培养48 h后用原有培养液吹起细胞，收集离心，吸去上清液，加入1 ml磷酸缓冲液洗两次。然后提取DNA，在2﹪琼脂糖凝胶上电泳2 h，电压为80 V，紫外透视仪观察、拍照。 　　2.3 MTT法 测定五加皮多糖对hela细胞的增殖抑制作用。不同浓度五加皮多糖作用于hela细胞，对hela细胞的生长具有不同程度的抑制作用。在培养24～48 h过程中，五加皮多糖对hela细胞的抑制作用逐渐增加，并随药物浓度的增加，对hela细胞的抑制率逐渐升高，其抑制率见表1。 　　表1 五加皮多糖对hela细胞增殖的影响（略） 　　*代表24 h和48 h的1～5组对hela细胞抑制率的对比呈显著差异 　　2.4 DNA凋亡带的观察Hela细胞经不同浓度五加皮多糖处理48