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第五章 种子制备与菌种保藏 第一节 种子制备（Inoculum development） 定义：由保藏的菌种开始，经过逐级扩大培养，最后获得 供生产车间发酵罐接种的足够数量和优质质量的种子。 种子扩培的目的： 接种量的需要 菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平 种子的要求： 总量及浓度能满足要求 遗传表现型要稳定，不易退化 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长 无杂菌污染 对环境条件要有比较大的承受能力 生产种子制备的一般流程 实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此形象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子制备。 生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般归为发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段的种子制备。 几个概念 种子罐级数：种子在种子罐中需扩大培养的次数。 发酵级数：种子罐的级数加一。 接种量：放罐的种子罐的培养液体积除以接种后培养液的体积的百分数。 种龄：生产种子的培养时间。 斜面种子的制备 1.斜面种子：在试管或扁瓶内，以琼脂固化的培养基表面上生长的菌种培养物。 2. 制备流程： 3. 制备过程注意事项 (1)??琼脂要完全浸没在营养液内,用量1.0%-2.5% (2) 营养液中最好不含易沉淀的固形物； (3) 装量掌握在斜面顶端不超过试管或扁平长度的2/3； (4) 灭菌后垂直放置至稍冷后再斜放，以减少冷凝水 (5) 微量元素先配制成一定的溶液，用移液管定量加入 4.质量检查 (1)?外观检查 (2)?无菌检查 (3) 摇瓶生产能力检查 5.影响斜面种子质量的因素 (1)原材料质量，水质，培养基pH， (2)灭菌条件， (3)接种量， (4)培养室温度、湿度、通风、 (5)培养时间， (6)有害气体或挥发物（培养室内不要安紫外灯） (7) 冷藏条件 二 、米粒种子（米孢子）的制备 1. 米孢子：将霉菌或放线菌接种到灭菌后的大米或小米颗粒上，恒温培养一段时间后产生的分生孢子。 2 . 米孢子制备工艺流程 3.?制备过程注意事项 （1）浸泡时间及加营养液量应掌握在灭菌后米粒熟透但不粘连； （2）分装量应掌握在平铺后有2-3粒米的厚度 （3）米粒不要碰到瓶塞； （4）培养前期应经常摇动米粒，使微生物在米粒表面生长均匀，气生菌丝及孢子长成后不再摇动。 （510%-20%甘油浸泡保存 4. 质量标准 （1）无杂菌污染 （2）孢子数足够，发芽率高 （3）生产能力高 （4）真空干燥后含水量小于8% 5. 影响质量的因素及控制（同前） 三、种曲的制备（培养材料用麸皮、米糠等，其余同米粒种子） 四 、摇瓶种子的制备 1.摇瓶种子 : 将斜面种子或米孢子接种于锥形摇瓶内的液体培养基中，在摇床上振荡培养得到的液体种子。 2.制备流程 : 3. 制备过程注意事项 （1) 培养基营养成分含量应较斜面丰富，以确保一定的营养菌体生长量；能保持生长过程中pH稳定。 （2) 培养基装量适当，以保证良好的通气并与发酵罐通气条件相适应；参考装量为40-50 ml/ 250 ml瓶，60-80 ml/ 500 ml瓶，90-110 ml/ 750 ml瓶，120-150 ml/ 1000 ml瓶； 如果是厌氧培养，则装量应增加一倍以上； （3) 灭菌时要注意不要让蒸汽冷凝水打湿或粘污培养基在瓶塞或纱布上。 （4）注意摇床转速，转速越快，偏心距越大，通气越好。经常检查，皮带松弛时要紧一紧。 （5）注意摇床中心与边缘、上层与下层的温度。 4.质量检查： (1)? 菌体浓度：外观稠度，静置沉降率，离心沉降率。 (2)??菌体生长阶段：显微镜检查细胞分化情况。 (3) 代谢情况：对残余糖、氮进行化学分析，并测量pH值。 (4)??生产能力：摇瓶发酵试验。 (5)??污染杂菌情况：镜检及无菌试验检查 5. 影响质量的因素（同前） 五、发酵罐种子的制备 1.制备流程 ： ??????? 斜面、摇瓶或米粒种子 ↓ 培养基配制 → 实罐或连续灭菌 → 冷却 → 火圈或压力差接种 →培养→ 发酵罐种子 1) 培养基要求与发酵培养基大致相同，较摇瓶