LNA技术介绍.pdfVIP

Locked Nucleic Acid （LNA ） 在研究反义核酸技术的过程中，为了保护反义核酸免受核酸酶的攻击，开发出许多 种化学修饰的核苷酸，用于提高靶标亲和性、核酸酶抗性和药物动力学性质。其中Locked Nucleic Acid （LNA ）作为一种很有希望的核酸化学修饰技术引起广泛的关注。 1994 年，Rodriguez 等再发酵副产物中发现了LNA。1998 年，Koshkin 实验室进行 了LNA 的合成和杂交实验。由于LNA 和核苷酸在结构上十分相似，它对DNA 和RNA 有很好的亲和活性。和其它一些核酸修饰物相比，LNA 寡核苷酸有很多优点： 和DNA 或RNA 互补双链有很强的热稳定性，寡核苷酸中掺入一个LNA 碱基就可 以使熔解温度（Tm ）升高4 ～9℃； 抗核酸酶降解； 中心含有7 ～8 个脱氧核苷酸的DNA·LNA gapmer ，可以激活RNaseH ； 分子小，溶解度高，能自由通过细胞膜，机体容易吸收； 体内无毒性； 合成方法简单，可以用DNA 自动合成仪合成。 LNA 的结构： LNA是一种双环状核苷酸衍生物，含有2-O, 4-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖核酸单体， 即核糖的2氧原子和4碳原子通过一个亚甲基桥连接起来，如下图。这个环形连接限制 了呋喃核糖的灵活性，将其结构锁定成一个刚性的双环模式，增加了磷酸骨架局部结构 的稳定性。这种锁合的结构，有很多立体异构体，现在已经合成 的有β-D-Xylo-LNA 、α-L-LNA等。通过核磁共振( nuclear magnetic resonance , NMR) 研究水溶性DNA·LNA嵌合体与RNA及DNA杂 交后的构型变化发现，LNA能和RNA或DNA互补杂交，碱基配 对正常，且每个碱基都是反向构型 （β构型）。DNA·LNA嵌合体 与RNA杂交时，LNA碱基可诱导侧翼DNA碱基形成α构型。另外， 在LNA/RNA双链中，随着LNA增加，杂交双螺旋结构向A构型 变化。当寡核苷酸的碱基由β构型改变成α构型后，核酶不能识别磷酸二酯键，使得寡核 苷酸的稳定性将大大提高。而LNA杂交双链稳定性的提高，可能是也由于磷酸盐骨架局 部结构的调整，导致碱基堆积作用力增加的结果。 LNA 杂交亲和活性： 通过碱基互补配对，LNA可以和单链DNA (ssDNA)、双链DNA (dsDNA)、RNA及 LNA杂交，其中LNA/ LNA是最稳定的碱基配对结构。LNA和单链核苷酸杂交形成双螺 旋；在中性pH下，以Hoogsteen氢键结合到特异序列dsDNA大沟处形成三螺旋寡核苷酸 （triplex-forming oligonucleotide , TFO ）。LNA与互补单链核苷酸杂交，亲和性比相应 的寡核苷酸高得多，形成的杂交物的解链温度都很高。在寡核苷酸中每引入一个LNA碱 基，Tm值最多可提高9.6 ℃，再引入LNA ，每个LNA所带来的ΔTm降低。10nt的寡核苷 酸在引入LNA时，对Tm值影响最大。LNA与核酸杂交有严格的序列特异性，比普通寡 核苷酸更有效地区分碱基错配（mismatch ）。有错配的LNA/DNA双链比相应有错配的 DNA/DNA双链更加不稳定，在LNA/DNA双链中的一个错配至少使Tm值下降20℃，而 DNA/DNA双链中，一个错配只能使Tm值下降4 ～16 ℃。另外，LNA与DNA还可形成三 明治式的LNA/DNA/LNA结构，也具有很好的热稳定性和生物学活性。 LNA 的酶学特性 RNase H是一种广泛存在的酶, 1982年由Criych等发现，特异切割DNA复制时形成的 RNA/DNA双链中的RNA链，产生5-P和3-OH末端。研究发现，只要有4个nt的DNA片段 与mRNA结合，就能激活RNase H降解mRNA。仅含有LNA的寡核苷酸可以和RNA形成 A型螺旋，阻碍RNase H降解RNA。但是通过构建中心含有7-8个脱氧核苷酸的DNA·LNA 嵌合体gapmer ，可以激活RNase H ，并且由于LNA的高亲和性促进RNase H的切割。LNA 寡核苷酸虽然不能激活RNase H ，但它可通过空间位阻抑制基因表达。比如：LNA和 LNA·DNA可以通过与荧光素酶mRNA上的许多区域结合抑制该基因表达。可以根据不同 的实验策略和靶物需求，利用或抑制Rnase H活性。另外，LNA/DNA/LNA 嵌合体亦能激活 Rnase H。 LNA和DNA ·LNA还表现出抗核酸