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Western Blot 详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western 免疫印迹（Western Blot ）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进 行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产 物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下 Western Blot 技术: 一、原理 二、 分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光 ECL iii.底物荧光 ECF iv.底物 DAB 呈色 三、 主要试剂 四、 主要步骤 五、 实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 5.Marker 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问 8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、 原理 1975 年，Southern 建立了将 DNA 转移到硝酸纤维素膜（NC 膜）上，并 利用 DNA －RNA 杂交检测特定的 DNA 片段的方法，称为 Southern 印迹法。 而后人们用类似的方法，对 RNA 和蛋白质进行印迹分析，对 RNA 的印迹分析 称为 Northern 印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为 Western 印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为 Eastern 印迹法。 与 Southern 或 Northern 杂交方法类似，但 Western Blot 采用的是聚丙烯酰 胺凝胶电泳 ，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过 PAGE 分离的蛋白质样品 ，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载 体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不 变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶 或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的 特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈色，体同水平和实验条件的是用第 一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光 ECL。只要买现成的试剂盒就行， 操作也比较简单，原理如下（二抗用 HRP 标记）：反应底物为过氧化物 +鲁米 诺，如遇到 HRP ，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 三、主要试剂 1、 丙烯酰胺和 N ，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺) 的去离子水配制含有 29%(w/v)丙稀酰胺和 1%(w/v)N ，N’-亚甲双丙烯酰胺储 存液丙稀酰胺 29g ，N ，N-亚甲叉双丙稀酰胺 1g ，加H2O 至 100ml。)储于棕 色瓶，4℃避光保存。严格核实 PH 不得超过 7.0 ，因可以发生脱氨基反应是光 催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可 以过滤。 2、 十二烷基硫酸钠 SDS 溶液:10%(w/v)0.1gSDS ，1mlH2O 去离子水配制， 室温保存。 3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris 和 48ml1mol/LHCL 混合，加水稀释到 100ml 终体积。过滤后 40C 保存。 4、 浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris 溶于 40mlH2O 中， 用约 48ml 1mol/L HCL 调至 pH6.8 加水稀释到 100ml 终体积。过滤后 40C 保 存。这两种缓冲液必须使用 Tris 碱制备，再用 HCL 调节 PH 值，而不用 Tris.CL。 5、 TEMED 原溶液 N ，N ，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加 速两种丙稀酰胺的聚合。PH 太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶 液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数 ml ，临用前配制. 6、 SDS加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris 缓冲液 8ml ，甘油6.4ml ， 10%SDS 12.8ml ，巯基乙醇3.2ml ，0.05%溴酚蓝 1.6ml ，H2O 32ml 混匀备 用。按 1:1 或 1:2 比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮 3min 混匀后再上样，一 般为 20-25ul ，总蛋白量100μg。 7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris ，188g 甘氨酸，10gSDS ，用蒸馏水溶解 至 1000ml ，得0.25mol/L Tris-1.92mol/L