应用寡核苷酸芯片进行HLA.docVIP

　　应用寡核苷酸芯片进行HLA 作者：王彤，王天骄，何群，张玉魁，马佳明，侯伟建， 王绍成，潘忠诚，赵雨杰 【摘要】 为了构建HLA-DQA1位点寡核苷酸分型芯片并籍此建立一种 应用 于HLA系统基因分型的集成化技术平台，在多态性集中的HLA-DQA1第二外显子区域，自行设计一套寡核苷酸分型探针；采用本实验室自建的 方法 ，制成寡核苷酸芯片。提取的基因组DNA以组间特异性引物，单侧引物荧光标记，行不对称扩增。杂交后扫描检测 分析 杂交信号，确定HLA等位基因型；分型结果以标准DNA和PCR产物测序检测。结果表明： 100例样本芯片分型全部成功，其中50例标准DNA与其模板相符，另50例临床样本中随机选取的10例与其测序结果相符，其中2例分型结果不完全；重复杂交实验中，位点重现率95%。结论： 研制的HLA-DQA1等位基因分型芯片，其准确性和重现性理想，且操作简便、快捷，有广泛的应用前景。 【关键词】 基因分型 　　HLA-DQA1 Genotyping by Using Oligonucleotide Microarrays 　　Abstract In order to fabricate the HLA-DQA1 genotyping chip and develop an integrated，parallel technical platform to type HLA system，a pair of primers and a set of probes orphism is concentrated. The oligonucleotide chip ade ethods developed in our laboratory. The target DNA metrically amplified er. The signals icroarray and PCR product. The allele types of the samples ples and 50 clinical samples. Among them，results of the 50 standard DNA samples matched thEir templates. In the other 50 samples，results of the randomly selected 10 matched thEIr sequencing results except that t got the inpletely result. In reproducible tests，the signal reappear rate is simple and convenient icroarrays），对HLA-DQA1位点进行基因分型检测，旨在建立一套成熟的分型技术，用于复杂的HLA系统的分型研究。 　　材料和方法 　　DNA样本 　　50例临床样本采自 中国 医科大学附属第一 医院 ，50例标准DNA样品由中国刑警学院法医系法医学教研室提供［7］。 　　主要试剂及仪器 　　手臂分子氨基丙基三乙氧基硅烷 (APTES)(Sigma公司)，PCR试剂盒及相关试剂(Promega公司)，鲑鱼精DNA（Sigma公司），其他化学试剂均为分析纯。PCR扩增仪（Biometra Personal PCR system，USA），生物芯片点样仪(MGⅡ600，BioRobotics，England)，激光共聚焦扫描仪(Gene TACTM LS IV，Genomic Solutions Inc. USA) 　　引物及探针 　　根据GenBank数据库新近公布的HLA- DQA1等位基因序列，在多态性集中的exon 2保守区及变异区分别设计1对引物及16条特异性分型探针，交由上海生物工程公司合成，并在正义链引物5’ 端作FITC标记，序列如下： P1(+)Exon2: 5’-TGTATT ACATGGGAATATGTGATTTTAGA-3’；P2(-)Exon2: 5’-CAGGGGTTGGAAATGTCCAC-3’，并在各探针5’ 端做氨基修饰。各组探针的序列见附表。 　　全血基因组DNA的提取 　　改良的酚/氯仿法: 1 ml抗凝的外周血，896×g离心5分钟，分离中层白细胞后，传统酚/氯仿/异丙醇法［8］抽提DNA，-20℃保存。 　　PCR扩增与产物标记 　　扩增体系20 μl，含基因组DNA 1 μl。以组间特异性引物，行1∶20不对称扩增。扩增条件96℃ 5分钟，96℃ 30秒，59℃ 40秒，72℃ 40秒，35个循环。产物以聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测。 　　载片制备 　　本室自建流程。市售玻片（2