2012年qPCR原理和分析方法.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 样品制备 环境要求 模板准备 数据分析 RT 上机 浓度确定 SYBR法实验流程及注意事项 无RNase环境 使用无RNase耗材 专用RNase-free工具 高纯度，浓度均一的RNA 分光光度计检测 电泳检测 RT 反应体系优化 试剂选择 样品制备 模板准备 数据分析 上机 AMV M-MLV Quant Super 下游反应数确定反转录体积 选择应用引物 高效、全长的cDNA SYBR法实验流程及注意事项 模板准备 引物设计 浓度确定 环境要求 误差控制 RT 样品制备 数据分析 上机 核酸制备区 反应液制备区 制作标准曲线 设定浓度区间 评价引物 使用mix降低系统误差 设置重复（≥3次） 设置空白和阴性对照 均一的反应液和模板混合物 GC％：50－60％ Tm：50－65℃ 单个碱基重复＜4个 无二级结构 扩增长度：100－200bp 反应体系优化 上机 反应条件优化 RT 样品制备 模板准备 数据分析 反应体积＞5ul，推荐20－50ul Mg2＋调节，酶活调节 引物浓度优化，模板量优化 退火温度优化：梯度PCR 延伸时间：产物长度决定 扩增效率：90％－110％ 重复性：std＜0.2 标准曲线：R＞0.99或R2 ＞0.98 SYBR法实验流程及注意事项 标准品