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对古生菌硫磺矿硫化叶菌功能未知蛋白序列引物设计及PCR扩增 生112-1 刘群 201170502138 【目的】 根据Vector NIT Suite 8软件，利用所给古生菌硫磺矿硫化叶菌的16srRNA，进行酶切，找出可以将其功能未知蛋白序列80—709完整切下的酶，结合琼脂糖凝胶电泳将这段序列找出，然后用这个软件设计引物进行PCR扩增，从而用于以后各项分子生物学的研究。 【工具】 Vector NTI Suite 8 应用此软件可以对硫磺矿硫化叶菌的16srRNA进行酶切，以及通过电泳选出功能未知蛋白序列，同时可通过一定程序设计出引物进行PCR扩增。这个软件可以模拟真实情景，在网络上完成酶切、电泳以及引物的设计，简化了实验步骤使选择过程更加的简单、快捷。 【材料】 古生菌硫磺矿硫化叶菌的16srRNA 硫磺矿硫化叶菌（古生菌界，泉古菌门，热变形菌纲，硫化叶菌目，硫化叶菌科，硫化叶菌属） 【方法步骤】 利用Vector NTI Suite 8软件对硫磺矿硫化叶菌的全部的16srRNA进行所有酶的酶切。 根据上述酶切结果，以及电泳的结果找出可以将硫磺矿硫化叶菌的功能未知蛋白序列（80—709）完整切下的酶，根据电泳的性质找出该条带。 利用这个软件设计出该序列的正向引物和反向引物，根据引物设计原则选择出最适合的引物进行PCR扩增。 利用Vector NTI Suite 8软件对硫磺矿硫化叶菌的全部的16srRNA进行酶切的结果如下： 寻找可以将硫磺矿硫化叶菌的功能未知蛋白序列完整切下的酶 分析：1、由于将功能未知蛋白序列切下之后还要设计引物进行扩增，因此在这段80—709序列前后仍要保留一段序列，防止我们所需要的序列在扩增之后被切除。因此这段序列的前边不需要进行酶切，保留80之前的片段，只需要在709之后寻找一个酶，使这个酶在709之后有一个酶切位点而在80—709之间不存在酶切位点。这样既可以保证这段序列被完整的切下，又可以确保在下一步设计引物进行扩增完成切掉引物后这段序列不会被切除。 2、根据上图可以看出，BstIZ316I和AdeI在980处都有酶切位点，因此用这两种酶分别进行酶切 ，用这两种酶分别进行酶切的结果如下： 由上图可以看出：酶BstIZ316I和AdeI这两种酶在这段RNA序列上只有一个酶切位点，均在980处，可以将我们所需要的序列完整的切下，因此为获得这段完整的RNA序列，我们可以选取这两种酶中的任意一种进行酶切。 然后分别将这两种酶的酶切结果进行琼脂糖凝胶电泳，结果如下图： BstIZ316I酶切电泳结果 AdeI酶切电泳结果 从电泳结果可以看出，这两种酶均能将这段序列切成两段，推断它们就只有在980处这一个酶切位点，因此这两种酶均可成功的将这段我们所需要的蛋白序列切下来。这两段序列分别是1—980，981—12389.根据电泳的性质，相对分子质量小的条带在电泳时移动的速度快，因此可回收那段在前面的条带（也可根据分子量的大小选择分子量小的那个条带），即我们所需要的该古生菌的功能未知蛋白序列。 收集完条带之后我们需要进行引物的设计来对其进行扩增： 引物设计的基本原则为： A 长度在18~35bp，GC含量在40%~60%之间，内部无发卡结构 B 引物之间避免形成二聚体； C 引物3’端和模板之间不应少于12个连续碱基相匹配； D 在模板基因内部不应有和引物对中任一条引物相似的片断；有时需要在引物的3’端加上适当的酶切位点。 E. 引物3′端不能选择A，最好选择T。 F. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 引物的5′ 端决定着PCR产物的长度，引物5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等 首先运用Vector NTI Suite 8软件进行正向引物的设计，输出的三个引物分别是： PCR Analysis #1: Product of length 66 (rating: 153) Contains region of the molecule from 3 to 68 Tm: 58.4 C TaOpt: 38.1 C GC: 21.2 Sense Primer: AATCTTCCAATTATTTCAGTAG Similarity: 100.0% Length: 22 Tm: 42.4 C GC: 27.3 dH: -161.7 kcal/mol dS: -432.9 cal/mol dG: -30.9 kcal/mol