good12基因工程的基本操作程序.pptVIP

基因表达的计算 在真核生物中，对应的是 的碱基数 二、基因表达载体的构建 ——基因工程的核心 1 目的： 使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可 以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达 和发挥作用。 2 基因表达载体的组成： 复制原点+目的基因+启动子 +终止子+标记基因 表达载体 启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质 终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录 标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来 基因表达载体的构建过程 质粒 DNA分子 限制酶处理 两个切口 获得目的基因 DNA连接酶 重组DNA分子（重组质粒） 同一种 一个切口 两个黏性末端 注意： ①载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分DNA片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构 ②用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到DNA连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键 ③启动子、终止子对于目的基因表达必不可少 ④目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。 三、将目的基因导入受体细胞 1 转化： 目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞 内维持稳定和表达的过程。 2 常用的受体细胞： 大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌 和动植物细胞等。 3 目的基因导入受体细胞的原理： 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。 1、目的基因导入植物细胞的方法 （1）农杆菌转化法 ①农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植 物，对大多数单子叶植物没有感染能力。 ②原理：Ti质粒上的T---DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。 三、目的基因导入受体细胞 构建基因表达载体 转入 农杆菌 植物细胞 导入 稳定维持和表达 ③过程： 1、目的基因导入植物细胞的方法 （2）基因枪法：目的基因导入单子叶植物细胞 ①操作方法：利用压缩气体产生的动力 ，将包裹在金属粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。 ② 钨粉粒子和金粉粒子，粒子的直径一般在0.6～4um 。 ③适用：单子叶植物 1、目的基因导入植物细胞的方法 （3）花粉管通道法：将目的基因导入植物细胞 ①操作方法：在植物花受粉后，花粉形成花粉管还末愈合前期，剪去柱头，然后，滴入DNA（含的基因）使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞 ② 特点:十分简便经济。 ③例：转基因抗虫棉 2、将目的基因导入动物细胞 ①方法：显微注射法 ①程序 目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵） 显微注射 受精卵 新性状动物 3、将目的基因导入微生物细胞 ①微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 ②常用菌：大肠杆菌 ③常用法：Ca2+处理获得感受态细胞 ④过程： Ca2+处理 大肠杆菌 感受态 细胞 感受态细胞 吸收DNA 表达载体 与感受态 细胞混合 小结：将目的基因导入受体细胞 生物种类 植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法 显微注射技术 Ca2+处理法 受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞 转化过程 将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA→表达 将含有目的基因的表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子 四、目的基因的检测与鉴定 导入过程完成后，全部受体细胞都能摄 入重组DNA分子吗？ 1 真正能摄入重组DNA分子的受体细胞很少。 2 目的基因进入受体细胞后，是否都能稳定维持和表达？ 不一定，需要检测 1、鉴定——分子水平的鉴定 转基因生 物的DNA 探针 15N 15N 14N 14N （1）检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了 目的基因 基因探针： 放射性同位素等标记的DNA分子 方法—— DNA分子杂交技术 变性 变性 1、鉴定——分子水平的鉴定 变性 方法—— 分子杂交技术 （2）检测目的基因是否转录出了mRNA 探针 15N 15N 转基因生物 的mRNA 14N 14N 1、鉴定——分子水平的鉴定 提取 （3）检测目的基因是否翻译成蛋白质 方法——抗原-抗体杂交 苏云金杆菌 Bt毒素蛋白 将Bt毒蛋白注射小鼠体内 从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体 抗体 蛋白质 出现杂交带