菌落PCR(ColonyPCR)方法经验.PDF

菌落PCR （Colony PCR）方法经验 菌落 PCR （Colony PCR）可不必提取基因组DNA，不必酶切鉴定，而是直接 以菌体热解后暴露的DNA 为模板进行PCR 扩增，省时少力。建议使用载体上的通 用引物。通常利用此方法进行重组体的筛选或者DNA 测序分析。最后的PCR 产物 大小是载体通用引物之间的插入片断大小。 菌落PCR 菌落PCR 与我们通常的普通DNA 的PCR 的不同在于，直接以单个菌作为模板。 是一种可以快速鉴定菌落是否为含目的质粒的阳性菌落。操作简单，快接，阳性 率较高，在转化鉴定中较常见。 操作方法： 1，挑取单个菌落，可以用高压灭菌的牙签。现在含抗性的平板上画线，做保种 用，然后置于 20ultriton－x100 中搅和一下，将相应的菌和板子上的画线区做 上对应的记号 2，将装有20ulTritonx－100 的EP 管100 度煮2 分钟 3，按照菌中预期包含的质粒加好PCR 体系，建议做20ul 体系，模板加煮过的菌 的上清1ul 4，上机即可。退火温度可以稍低，虽然没有什么根据可言，但是个人经验，推 荐比质粒PCR 时稍低 5，电泳，看结果，阳性的菌落对应的板子可以直接挑菌小摇，保种或者送测序 都可以 我的做法： 用枪头挑选单菌落到装有20uL 水的pcr 管中，然后悬浮菌液。 在做 PCR 时，吸取 1uL 做摸板，但电泳检测后，选有阳性克隆相对的菌液 10uL 与试管的液体培养基中培养。这样做， 既初步检测了阳性克隆，又保存了所需 要的菌落。 当然，在挑菌时也有用接种环挑的， 有用牙签挑的， 看个人的爱好了 我们都是直接拿牙签挑单菌落往PCR 反应体系中搅拌一下，一般都能鉴定出来。 想节省麻烦的话，还可以菌落鉴定同时挑单克隆，用 1.5 的EP 管装 1mL 左右培 养基，牙签挑出菌落后先在培养基上搅拌然后再放到PCR 反应体系中。 把PCR 体系先加好，用接种针直接往菌落上戳一下然后伸到体系里面晃晃就可以 上机P 了，我每次都是这样，可能是最方便的方法了。 取200ul 水，牙签挑菌，煮沸5 ‘，冰浴5’，12000rpm，取上清5ul 做模版。其 他的和普通pcr 一样。 我们都是用过夜培养的菌液 0.3ul （不要超过0.5ul）做模板，很简单的，其它 都不变。先94 度5min 裂解菌，最好5min 后再加入taq 酶。 是的，菌落 PCR 不难。。但是如果发现结果出现非特异带，在目的带位置有很弱 的条带出现，最好再用液体培养后再做一次PCR,我就因为这个阴性结果折腾了 1 个月。。扩培后再作菌落PCR 就得到阳性结果了。。 我是这样做的,取菌液60ul 至ep 管中,沸水中煮5min,离心,取其中上清1ul作模 板,屡试不爽 拿牙签点一下菌落然后再体系里面涮一下就可以了 如果觉得不可靠，就索性接个种，摇个小管，然后取1ul 作模板 模板如果太多了，引物就不够用了，显然扩不出来，这种现象在质粒这种模板的 PCR 里面很多，你提出来的质粒不要忘记稀释 一般来说, 菌落 PCR 能够筛选阳性克隆. 象你的实验中出现的这种假阳性结果, 也不是什么太反常的事情, 细菌本身的基因组也是反应系统中的组分, 所以难 免有些假阳性的结果. 建议多用几对不同的引物扩增, 以增加真阳性筛选结果. 一般会出现假阳性，可能是粘在菌落上的目的基因被污染，建议引物一个为目的 基因一个为载体上的，用无菌牙签挑取菌落，在配好的 PCR 体系中赞一下，PCR 反应条件为95 度 10 分钟94 度40 秒退火55 度40 秒72 度 1 分钟30 个循环 建议酶切后鉴定时同时取一个未做酶切的质粒做对照，明确是否能切断，再考虑 是否能切出目的片段。 假阳性并不高，可挑菌落摇菌 12 小时以上再取菌液pcr,初始变性温度可设为98 度。 我们一般将接种好的菌液煮沸 15min，4000rpm 离心5min，用上清作模板，效果 很好。 非常方便的方法,我做了不知多少次,从未失手. 1.挑取菌落加入50ul dd 水中,振摇. 2.99 度, 5灭活菌液中的酶 3.12000rpm 离心1去除细胞碎片 4.取上清pcr,50ul 体系取 10ul 我做就是将菌株挑一点点加入 PCR 体系中,涮一涮.我没有煮沸和离心.剩下的菌 落放到37 度继续让它长大一些,方便接种. 刚做的时候强烈建议大家要做阴性对照和阳性对照,因为有时候会有假阳性,即 使阴性对照也会在目的位置出现条带,只是亮度弱一些而已. 我的经验是:若是真阳性,会很亮,让你不会怀