鸡β防御素1重组毕赤酵母的制备与表达.pptVIP

鸡β-防御素-1重组毕赤酵母的制备与表达 姓名：庄 杰 导师：张兴群 概述 β-防御素是鸡体内的一种重要抗菌肽，除了具有直接的杀菌、抗病毒作用外，它还参与机体免疫反应，如今由于抗生素的滥用引发的问题而日益引起人们广泛关注。 动物防御素具有代替传统抗生素的潜力，主要表现在：抗菌谱广，免疫原性无或低，对人畜无毒副作用，无残留，无耐药性，热稳定性和溶解性良好，对较高离子强度或较大pH变化耐受性较好。因此，防御素越来越受到研究人员的关注。 防御素 防御素是一类碱性阳离子抗菌肽，相对分子质量为3500-4500左右，分子中含有6-8个保守的半胱氨酸残基，形成3-4对分子内二硫键，并通过半胱氨酸分子间二硫键使肽环形成反向平行的 β-片状结构。根据其分子内半胱氨酸的位置和连接方式及前体性质的差异可分为 α-防御素、β-防御素、θ-防御素、昆虫防御素和植物防御素。防御素具有广谱抗微生物作用，包括各种细菌、真菌和一些具膜病毒，为机体抵御外界微生物侵袭的第一道屏障。 抗菌机理 防御素种类多种多样，抗菌谱也各不相同。不同的防御素的作用方式可能不同，同一种防御素与不同微生物作用时机理也可能不同。防御素的杀菌机理主要有以下几种： 1. 破坏细胞膜，形成离子通道 防御素可以通过电荷间的相互作用与细胞膜外层结构结合，其疏水部分在疏水作用和分子张力作用下，能够改变细胞膜的流动性和厚度，从而使细胞膜上出现孔洞，导致细胞质外渗或细胞外的物质进入到细胞内，严重时会引起细胞膜崩解，导致细胞死亡。 抗菌机理 2. 抑制胞外大分子的合成 防御素对肽聚糖、几丁质及一些生物大分子合成、交联的抑制也可能是其重要的杀菌机理之一。 3. 抑制胞内功能 防御素也能够破坏某些重要的胞内过程，从而促进细胞死亡。在某些实验中发现微生物能够在膜不完整的情况下存活更长的时间，这就预示着防御素可能有非膜破坏杀菌机制的存在。 抗病毒机理 防御素抑制和杀伤肿瘤细胞的机制与杀菌的机制不尽相同，它比杀菌机制更为复杂。一方面，它能通过其细胞毒性，主要是对细胞膜、核膜、线粒体、细胞核染色体和细胞骨架等的损伤来达到杀伤肿瘤细胞的效果；另一方面，防御素能通过调动机体免疫机能，从体液免疫方面来抵抗癌细胞的入侵。 防御素的应用现状 1 在医药行业的应用 细菌对传统抗生素的耐药性是当今全球性难题，防御素因其具有广谱的抗菌活性，独特的抗菌机理，并与典型的抗生素具有协同作用，能中和内毒素，调节机体免疫应答和炎症反应，调节组织创伤修复等特点引起了人们的广泛关注 2 在食品行业的应用 在食品方面，防御素主要用作防腐剂，防止食品腐败变质。 防御素的应用现状 3 在农业上的应用 防御素在农业中可用于农作物抗病育种。 4 在畜牧业上应用 防御素作为饲料添加剂对细菌具有很强的抑制作用，能够促经畜禽生长，提高饲料的利用率，动物在采食以后不会再体内残留。 酵母表达系统 酵母是目前研究比较成熟的一种表达系统，研究表明，防御素在酿酒酵母中的表达水平较低，而选用毕赤酵母则可获得高效表达，其表达水平高达70 mg/L，且重组肽具有与天然肽相似的二级结构和生物活性。 酵母表达系统 作为外源蛋白表达系统，毕赤酵母有其独特的优势：遗传操作简单；对重组蛋白可以进行翻译后加工修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；具有强有力的乙醇氧化酶(AOXI)基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；对需氧生长有强的偏好，这一生理学特性使它能高密度发酵生长，表达量高，对工业放大生产有利；毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少，有利于外源蛋白的分离和纯化。 防御素毕赤酵母的构建及筛选 利用 TRNzol 试剂盒从安徽三黄鸡肝脏中抽提总 RNA，并进行电泳检测；根据 Genbank 中登录的鸡 β-防御素-1基因序列，设计一对特异性引物，利用设计的引物扩增 Gal-1 成熟肽基因片段；将此片段与 pMD-18-T 载体相连，构建重组克隆载体pMD-18-Gal-1，转化大肠杆菌 DH5α 后进行鉴定、序列测定；后将测序正确的目的片段与载体 pPIC3.5K 连接，构建重组表达质粒 pPIC3.5K-Gal-1，单酶切后用电转化的方法将构建的重组表达载体整合入毕赤酵母 GS115 中，然后进行了高拷贝的筛选和表型的鉴定。 高拷贝筛选 一般情况下，整合到酵母染色体上的基因拷贝数越多，蛋白表达量就越高。pPIC3.5K 含有 neo 基因，赋予毕赤酵母 G418 抗性。而 G418 抗性水平主要依赖整合的 neo