实时荧光定量PCR技术原理应用及实践第2代染料.pptVIP

通过实验选择Housekeeping gene 实测多个备选Housekeeping gene 以各备选基因的几何平均数为均一化标准，检验各基因在给定条件下的表达稳定性 参考资料 geNorm 网站 - http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/ Vandesompele et al., Genome Biology, 2002, Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes Master mix的优化DNA聚合酶 Hotstar 化学修饰，低温下酶活抑制强，热复活需10分钟 Fast Hotstar 抗体或oligo修饰，热复活仅需几十秒 CW0696 CW0704 Master mix的优化荧光染料 新型荧光染料(SuperGreen) 激发、发射波长与SYBRgreen近似 对PCR反应抑制更轻微 可使用较高浓度(1uM, SYBR green 0.3uM)更亮，灵敏度更高 较短的链延长时间 对小片段DNA和ssDNA结合更弱 减少背景，有效信号更强 与更强的信号协同，使溶解曲线峰更窄，适合于HRM分析 化学性质更稳定 致突变性与毒性更弱 SYBR GREEN 染料 新型荧光 染料 荧光 染料 反应条件优化Master mix的选择 Buffer – 添加剂的使用 反应增强剂 减少模板二级结构影响 控制Mg2+浓度 稳定剂….. 其它原理…. 使用添加剂 未使用添加剂 Master Mix的优化 对仪器的适应性 康为MasterMix 在多种不同品牌，不同档次，性能各异的Real-time PCR仪上进行优化 Master Mix的优化对仪器的适应性  某其它品牌 康为 采用cDNA用内参actin引物进行扩增，产物片段100bp。模板浓度进行10倍稀释，稀释5个梯度，每管做2个平行，同时做阴性对照 Master Mix的优化校正染料 ROX Passive Reference 不参与、不干扰PCR反应 恒定发射荧光信号 用于校正因信号检测器到各孔间光路不同而导致的系统误差。 有不同系统，需参照仪器要求选择。 抗污染 污染警报：阴性对照出现阳性结果 污染源：先前PCR产物 对策：尿嘧啶糖苷酶（UNG）尿嘧啶DNA糖基化酶 （UDG） 方法： 反应中用dUTP取代dTTP 反应中加入UNG 反应升温前在37oC孵育数分钟，使UNG降解含UTP的DNA（先前PCR产物） Trouble shooting 常见问题 可能原因 解决方法 Housekeeping gene 无信号 RNA降解 用新鲜组织提取RNA Housekeeping gene 有信号 而目标基因无信号 1. 目的基因表达低。 逆转录效率不高 2. PCR引物不良 1. 富集mRNA 2. 在逆转录中尝试不同引物，如特异引物。 3. 尝试不同PCR引物。减小产物大小，改换目标 区段，考虑不同剪接体。 4. 尝试不同热循程序，降低复性温度。 Housekeeping gene 反应效率正常,但 目标因放大效率不高 PCR引物不良 重新设计引物，减小产物大小，改换目标区段， 考虑不同剪接体 目标基因表达丰度在 样本之间异常一致 RNA被基因组DNA污染 使用跨intron 引物 用DNase处理RNA 确保RNA阴性对照表现阴性 溶解曲线出现杂峰 出现非特异PCR产物 出现引物二聚体 尝试不同PCR引物 尝试不同热循程序，升高复性温度 修改仪器设置，将检测温度设定在在引物二聚体解链温度与PCR特异产物解链温度之间。 阴性对照在30个循环 以内出现信号 试剂被污染 注意区分信号是来自引物二聚体还是PCR产物 查找，替换污染试剂 使用UNG系统。 qPCR反应优化非关键技术外包服务 Housekeeping gene – 引物序列？反应条件？ 目标基因– 引物序列？反应条件？ 选择试剂，摸索条件，优化参数 – 两个月？ CoWin解决方案一：Primer assay 客户指定：物种，housekeeping gene，目标基因 客户得到：经实验优化、验证过的引物，反应条件参数，MasterMix 客户下游工作：Real-time PCR – 数据获取 CoWin解决方案二：全套qPCR服务 客户指定：物种，housekeeping gene，目标基因 客户提供：生物样