Folin 试剂法.ppt

福林-酚试剂法测定蛋白质的浓度 实验目的 学习福林-酚试剂测定蛋白浓度的原理和方法 掌握分光光度计和微量移液器的使用方法和用途 掌握什么是标准曲线，为什么制作标准曲线 实验原理 Folin-酚试剂法（Lowry法） 第一步——加碱性铜试剂 在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物（双缩脲反应） 实验原理 第三步——制作标准曲线 1：为什么制作标准曲线 溶液蓝色深浅(即OD值）与蛋白质含量成正比，可测得已知不同浓度梯度的蛋白质对应的OD值，根据浓度和OD值得回归方程即标准曲线，从而测得未知样品中蛋白质的含量。 2：如何制作标准曲线 利用excele软件 如何制作？ 如何评估？ 试剂和器材 试剂的配制 碱性铜试剂 试剂的配制 Folin试剂 实验方法 实验方法 以0号管为空白对照，在分光光度计上以波长650nm比色，读取光密度值（OD值）。 注意事项： 严格控制时间 及时做好标记 并且加一管之后把试管换一下位置； 加Folin试剂时应迅速混匀，加一管混匀一管，以便在磷钼酸和磷钨酸试剂被破环之前即能发生还原反应； 测定所加入的蛋白质量应在标准曲线范围之内。 结果与计算 根据测定的光密度值，绘制标准曲线： 每一点OD值取平均值，作为纵坐标，每管标准蛋白质含量（μg）为横坐标，制作标准曲线回归方程，并评估标准曲线（R2值应在0.99以上) 做标准曲线时调零管的数据切莫忘记 即（0,0）点 由标准曲线，计算待测蛋白质溶液的浓度： 分光光度计的原理 分光光度计的使用方法 开启电源，指示灯亮，仪器预热3分钟。 调节所需的波长，设置样品池个数 空白对照管调零（一定放在离自己最近的那个样品池） 将待测样品液放入比色皿（2/3高度），并将比色皿放入样品池内，盖好盖子，测光密度值（OD值），按上下键翻看其他样品池的数据 测量完毕，一定把比色杯用自来水和蒸馏水重新洗净，倒置于滤纸上晾干  比色皿有光面和毛面，勿用触摸光面，使用时光面对准光路； 盛液体时，需达到比色皿2/3左右；若液体不慎溢出，需用纸巾吸干 仪器如果沾有液体，请迅速擦干 禁止用手甩比色皿，预防脱手摔坏。 微量移液器的使用 操作步骤 1：选择量程 根据转移液体的量，选择正确量程的微量移液器； 2：调节吸量体积： 将微量移液器调至所需体积，千万不要将读数的调节超出最大值和最小值； 操作步骤 3：吸量 用移液器的吸杆插上合适的吸头，旋紧。 握紧微量移液器，用大拇指按至第一档，将吸头插入溶液中。 然后松开大拇指，慢慢释放按钮以吸取液体（否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部）；然后将微量移液器移出液面。 释放液体时，枪头接触在容器壁上，先慢慢按至第一档，停留1～2秒后，再按至第二档以排出所有液体。 操作步骤 4. 更换吸头： 吸取不同的液体，一定一定要更换枪头，防止试剂交叉污染，更换枪头时，对着废弃桶，轻轻按下卸载吸头的弹射器，吸头自然脱落在废弃桶内。 5. 微量移液器的放置： 实验完毕后，将移液器调回到接近最大量程，使弹簧处于松弛状态，放到或者悬挂在架子上。 注意事项 1. 吸取不同的液体时，切记要更换吸头， 2. 调节移液器时，动作要轻缓 ，千万不要将读数的调节超出最大值和最小值，否则会造成损坏。 3. 吸取液体时，动作要轻缓，防止液体随着气流进入移液器的上部； 4. 带有残余液体吸嘴的移液器不能平放。 5.每次实验完毕后将微量移液器调至接近最大刻度，使弹簧处于自然伸展状态。 6.必须定期让专业人员进行校正，不能火烧灭菌，不能摔。 * * ECNU 第二步——再加入Folin-酚试剂。 在碱性条件下，这种被作用的蛋白质上的酚类基团（酪氨酸）极不稳定，很容易还原酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，生成钨蓝和钼蓝的混合物，可利用分光光度计测得其OD值 实验原理 试剂和器材 牛血清白蛋白溶液 碱性铜试剂 Folin试剂 可见光分光光度计 移液管 微量移液器 碳酸钠10g + 氢氧化钠2g + 酒石酸钠0.25g 溶于500ml蒸馏水 ： = 1：50（V/V） 0.5g硫酸铜 溶于100ml蒸馏水中 A B 新鲜配制 钨酸钠100g + 钼酸钠25g + 蒸馏水700ml + 85%磷酸50ml + 浓盐酸100ml 回流蒸馏瓶 硫酸锂15g + 蒸馏水50ml + 溴数滴 定溶至 1000ml 文火回流10h 煮