猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用.pdfVIP

• 56 • 中国畜牧兽医 2014 年第 41 卷第 12 期 生物技术 猪瘟兔化弱毒疫苗中病毒含量实时荧光定量 RT-PCR 检测方法的建立及初步应用 范斌1 ，许文花1 ，韩建强2 ，马志亮1 ，胡骑3 ，信爱国3 ，张以芳l (1.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明 650201;2. 玉溪农业职业技术学院，云南玉溪 653106; 3. 云南省畜牧兽医科学院，云南省热带亚热带动物病毒重点实验室，云南昆明 650224) 摘要:为建立敏感、特异的评价猪瘟兔化弱毒(HCLV)疫苗中病毒含量的实时荧光定量 RT-PCR 方法，参照中国猪瘟石 门株兔化弱毒全长序列，在猪瘟兔化弱毒活疫苗基因组 5非编码区设计 1 对标准品引物、1 对特异性引物和 1 条探针，建立检 5 测猪瘟兔化弱毒活疫苗病毒含量的实时荧光定量 RT-PCR 方法。该方法检测的敏感度达1. 20X10 拷贝/mL;对猪繁殖与呼 吸综合征、猪乙型脑炎、仔猪副伤寒和猪伪狂犬病 4 种活疫苗基因组扩增结果均为阴性;重复性试验结果显示，批内变异系数 为 O. 29%~0. 39%.批间变异系数为 O. 32%~0. 61% 。应用此方法对 6 个不同厂家生产的 7 种猪瘟兔化弱毒活疫苗中病毒 含量进行了检测，发现不同厂家生产的疫苗中病毒含量存在较大差异。结果表明，建立的猪瘟兔化弱毒疫苗实时荧光定量 RT-PCR 方法能特异地检测疫苗病毒含量，可用于初步评价猪瘟兔化弱毒疫苗抗原含量。 关键词:猪瘟兔化弱毒;实时荧光定量 RT-PCR;病毒含量 文章编号:1671-7236(2014)12-0056-06 中图分类号:S852.4 文献标识码:A 猪瘟(classica! swine fever ,CSF)是由猪瘟病毒 有灵敏度高、特异性好、高通量检测等优点，己被广 (classica! swine fever virus , CSFV) 引起猪的一种 泛地应用于猪瘟病毒的检测(Hoffmann 等， 2005; Risatti 等， 2005; 王伟等， 2011 ;史子学等， 2007 ;李 高度接触性传染病。目前，中国猪瘟的流行以温和 军等，201 1)。国内多位学者也建立了针对中国猪瘟 型猪瘟和母猪持续感染引起的流产、死胎和新生仔 兔化弱毒疫苗株的实时荧光定量 PCR 检测方法 猪死亡为主;同时，猪瘟疫情表现复杂，区域性流行 (Zhang 等， 2012; 刘大伟等，2010; 邓力等，2011 ;陈 和零星散发并存;猪瘟免疫猪群频繁发病，往往还伴 玉栋等，2003) 或作为疫苗效价检验的替代方法(葛 随有多种原因引起的免疫失败，严重威胁养猪业的 叶等，2011 ;陈错等，2013) 。本研究针对猪瘟兔化弱 健康发展(王琴，2012) 。疫苗免疫接种仍是预防和 毒疫苗中病毒含量的测定，建立一种猪瘟兔化弱毒 控制猪瘟的重要于段，中国的猪瘟兔化弱毒(hog cho!era !apinized virus , HCLV) 是国内制备猪瘟弱 疫苗实时荧光定量 RT-PCR 检测方法，为猪场选择 猪瘟防疫疫苗提供一种快速检测方法。 毒疫苗种毒，用于生产猪瘟兔化弱毒疫苗细胞苗和 1 材料与方法 脾淋苗(仇华吉