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子宫内膜癌中p15及MDM2蛋白表达 作者：刘冬满 何世东 张志勇 郑寰宇 【摘要】 目的 采用流式细胞术并结合免疫组化法检测p15蛋白和MDM2蛋白在正常子宫内膜、良、恶性子宫内膜肿物组织中表达，研究其与原发性妇科恶性肿瘤的关系及三者在原发性妇科恶性肿瘤表达的相关关系。方法 采用石蜡切片，提取各个实验组的单细胞悬液，利用流式细胞术并结合免疫组织化学链霉素抗生物素蛋白过氧化酶结合法，分别检测子宫系列病变组织p15、MDM2表达情况。结果 从子宫肌瘤到子宫内膜癌，p15的表达量有明显进行性增高(P0.01)。而p15过度表达时(FI1.30)5年生存率很低。两组生存率比较有显著性差异(P0.01)；MDM2的表达在子宫内膜样癌为48.28% 、非子宫内膜样癌为41.5%，都明显低于功能性子宫出血诊断性刮宫标本的60.2%(P0.01)。结论 p15、MDM2蛋白表达异常可成为子宫内膜癌危险性评估、子宫内膜癌早期诊断及预后和复发判定的新途径。 【关键词】 子宫内膜癌；P15；MDM2，流式细胞术；免疫组化 1994年Kamb〔1〕等人首先报道p16和p15基因缺失与许多类型肿瘤有关，可能是细胞恶性转化过程的关键。有关p15基因在妇科恶性肿瘤中的情况研究较少，且大多针对p15基因在妇科恶性肿瘤中的纯和性缺失、突变和过度甲基化进行讨论。MDM2基因是p53的负反馈调节因子，是影响p53失活的因素之一， p15、MDM2蛋白表达异常的研究对临床具有重大的意义，将成为子宫内膜癌危险性的评估、子宫内膜癌早期诊断及预后和复发判定的新途径。关于子宫内膜癌中p15及MDM2蛋白表达与临床病理诊断的关系未见相同报道。本研究观察p15蛋白和MDM2在正常子宫内膜、良、恶性子宫内膜肿物组织中的表达，探讨其与原发性妇科恶性肿瘤的关系及三者在原发性妇科恶性肿瘤表达的相关关系。 　 　1 材料与方法 　　1.1 临床及病理资料 　　标本取自唐山工人 医院 病理科存档的原发子宫内膜癌组织50例，年龄50～75岁,平均62.6岁。所有患者术前未经放射 治疗 及化学药物治疗，根据1986年FIGO分期，分级按WHO标准，免疫组化采用石蜡包埋的肿瘤组织。正常的子宫内膜组织的供者10例，年龄58～73岁,平均65.8岁，为同期接受手术治疗的子宫肌瘤患者， 行子宫全切加一侧或两侧附件切除术,经组织学证实正常，以此作为对照组。 　　1.2 方法 　　1.2.1 流式细胞术检测p15蛋白 　　（1）准备单细胞悬液：选择组织结构完整，无变性及非相关成分的蜡块，切取厚度为0.05 mm的组织片5片，置于试管中，以二甲苯脱蜡，室温下24 h(中间更换二甲苯1次)。以100%、95%、70%、50%梯度酒精依序水化，每次10 min。弃酒精加入磷酸盐缓冲液(PBS)5 ml，5 min弃之。用Medimachine细胞制备仪制成单细胞悬液，用300目尼龙过滤除去组织块及细胞碎片。1 250 r/min离心，弃去上清液，加入PBS重悬，再1 250 r/min离心弃上清液，加入PBS重悬。计数，调节细胞数为1×109/L，待染色。（2）细胞间接免疫荧光标记法：单细胞悬液中加入1100稀释的p15蛋白多克隆抗体0.1 ml，轻微吹打混匀。37温水孵育30 min，离心弃上清，加入120稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG 50 μl，轻微摇动混匀，室温避光孵育30 min。离心弃上清，PBS离心洗2次(1 250 r/min)。弃去上清以除去未结合的多余荧光抗体。加入含1%多聚甲醛的PBS 0.5 ml，重悬，置于BD样品管中，4避光保存待测。除设正常子宫平滑肌组织为对照，还设立:PBS代替第一抗体(p15抗体)的阴性对照;只加入1100第一抗体100 μl的阳性对照;只加120第二抗体(FITCIgG)100 μl的阳性对照。（3）流式细胞检测:应用美国BD公司生产的FACSCalibur型流式细胞仪。激光波长488 nm。检测期间以标准细胞样品调整仪器变异系数(cv)值在5%以内。（4）结果分析:以荧光指数(fluorescence index，FI)表示p15表达的相对含量。FI=(肿瘤细胞p15表达的平均荧光强度-对照样品平均荧光强度)/正常子宫平滑肌组织p15表达的平均荧光度。FI1.0为阳性，Fl≤1.0为阴性，FI1.30为过度表达，FI≤1.30为低表达。 　　1.2.2 免疫组化法检测MDM2 　　MDM2单克隆抗体及EnVision复合物为Dako公司产品。主要步骤:病理切片常规脱蜡至水,在pH为6.0的0.01 mol/L枸橼酸溶液中进行抗原修复，加入MDM2单抗(MDM2 为150稀释)，湿盒中4过夜,加EnVision复合物室温