质粒提取和PCR样品纯化.pptVIP

质粒的提取（D/E/F） PCR样品的处理（A/B/C） 细菌生长各阶段的特点 两种培养基的比较 质粒提取过程中常见问题分析 1.加入P1后，菌液悬浮困难. 2.加完P1后发现没保菌。 3.加完P3后发现没加P2. 4.在同一排样品中加入了多份的P1，P2，P3. 5.吸上清时样品出现问题（2排样品吸在一排里面，吸入过多的蛋白） 6.高板离心时缺口未朝内，板子离碎。 7.离心完个别孔无样品。 8.离心完上清直接倒掉。 9.胶垫未盖紧，样品出现串孔。 10.异丙醇沉淀时，未注意离心已停止（不知停了多久) 定量稀释 根据与marker(D2000)对比片段大小，条带亮度进行定量并加TE或者ddH20稀释，如下图 PCR样品实验中经常出现问题 B类样品转C不严格 第一遍电泳无条带未跑第二遍复核 预检代码错误 未达到要求的安排上测序 样品质量不好，需试测的未试测 预检填错 实验中，偶尔出现试剂混加（如W1与PCR-A）、漏加（漏加W1，W2中未加乙醇） 信息不全或有问题样品需跟下一个班次或客服交接好 实验收尾工作 问题样品的操作记录，交接 实验室清洁 实验室消毒 优秀员工必须具备素质 心态要平和 注重细节 复核必不可少 * * * 质粒提取和PCR样品纯化 王忠杰 对含低拷贝质粒细菌的培养非常有利。 菌液达到稳定期时间短。 主要特征 1.C/N比对菌液生长的影响，偏高，菌体生长迅速，低拷贝质粒的复制速度可能赶不上宿主的复制速度。 2.TB培养基细菌生长速度快，大大的节省了菌液培养时间。 简要分析 Tryptone????????? 16g Yeast Extract???????10g??NaCl Tryptone?????????? 12g? Yeast Extract???? 24g ?Glycerol????????????4mL 磷酸盐缓冲液 营养成分/L 2xYT TB 质粒提取（碱裂解法） 此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、测序分析。 由于操作原因，提取的质粒可有三种结构：复性中间体、开环、闭环超螺旋。 质粒提取的思路 三个基本步骤： 细菌的生长 菌体的收集裂解及质粒DNA的分离 质粒DNA的纯化 要去除的物质： 　蛋白 　基因组DNA 　脂类及小分子杂质 　RNA 溶液 I 葡萄糖 Tris·Cl (pH8.0) EDTA (pH8.0) 高压下蒸汽灭菌15分钟，保存于4℃。 加入RNase。 作用：调节菌体细胞渗透压，分散菌体，给予溶液II 更大的作用空间。鳌合金属离子。 溶液 II NaOH SDS 作用：裂解菌体，使核酸和蛋白质变性。 溶液 III 乙酸钾 乙酸 作用：中和溶液II，质粒DNA复性，变性蛋白-SDS-基 因组DNA-K盐的溶解度比其Na盐更低，有利于蛋白混合 物的沉淀。 质粒提取操作流程 接菌 ? 振荡培养过夜 ? 离心，收集菌体 ? 溶液I悬浮菌体（充分振荡） ? 加入溶液II（涡旋振荡） ? 加入溶液III（涡旋振荡 ） ? 冰浴 ? 水浴 ? 冰浴 （以上三步主要是为了更好的沉淀蛋白等杂质） ? 离心聚集蛋白、基因组DNA等 ? 转移上清至滤板中 ? 离心收集上清 ? 加入异丙醇，颠倒混匀，离心沉淀DNA. ? 弃上清，加70%乙醇，离心. ? 弃上清，真空干燥. ? 加ddH2O溶解，振荡，离心. ? 电泳鉴定，定量，系统录入 原因分析：空载体。同种载体相同插入片段，出现大小明显偏小的条带。 结果分析 PCR类样品操作流程 核对样品信息 电泳，切胶 PCR样品纯化 定量稀释，系统录入 PCR样品纯化具体步骤 核对样品 ? 离心混匀 →→→ 鉴定电泳 ? ? ? 大孔胶电泳 条带单一直接纯化 ? ? 切胶 3倍体积PCR-A,混匀 ? ? 500ul DE-A溶胶6min左右 ? 250ul DE-B+150ul异丙醇混匀