cine化学辅助去核技术在牛体细胞核移植中的初步研究.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（１）：８７～９１ 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 殏檪檪 研究简报殏檪 檪檪檪檪檪檪檪檪 Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ化学辅助去核技术在牛体细胞 核移植中的初步研究 １ ２ １ １ ２ ２ ２ １，２ 沙　伟 　郭振华 　刘　赫 　殷志明 　马　红 　李仲秋 　吴赛辉 　刘　娣 （１黑龙江省哈尔滨东北农业大学动物科技学院　哈尔滨　１５００３０　２黑龙江省农业科学院畜牧研究所胚胎工程实验室　哈尔滨　１５００８６） 摘要　研究ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ辅助去核后的牛卵母细胞能否支持牛的核移植胚胎的发育。通过化学药 物ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ处理牛ＭＩＩ期卵母细胞后，借助显微操作去除牛卵母细胞核，并将去核的卵母细胞 作为受体，构建重构胚后观察发育情况。实验结果显示，ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ处理后牛卵母细胞质膜有明 显一个或二个突起，且突起内含有卵母细胞染色体，ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ辅助牛卵母细胞去核效果较好 （５７．８９％～７３．３％），处理时间以１ｈ为宜，去核率可达７３．３％。对ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ辅助去核后获得 的核移植胚胎发育情况显示，囊胚发育率较盲吸法去核核移植胚胎较好（１２．５％ ｖｓ１０．２％），但 二者差异不显著（ｐ＞０．０５）。Ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ辅助处理去核技术能有效去除牛卵母细胞核，且去核后 的卵母细胞能够支持核移植胚胎的发育。 关键词　秋水仙素　化学辅助去核　整细胞注入　体细胞核移植 中图分类号　Ｑ８１９ 　　１９９６年，随着第一只体细胞绵羊“Ｄｏｌｌｙ”的出 技术，进行体细胞核移植研究，期望能提高核移植胚胎 ［１］ 的生产效率［１１～１７］。此时，卵母细胞的化学辅助去核技 生 ，宣布了生物学界新时代的到来。许多科学家随 之涌入这个领域，在许多高技术设备的辅助下，近十年 术得到发展［１８，１９］，该技术方法对卵母细胞机械损伤较 来不断有新的动物被成功克隆，如：牛、小鼠、山羊、猪、 小，使细胞质及其中核重编程相关因子损失量小，增加 猫、兔、骡子、大鼠、狗［２～１０］等。但是尽管科学家花了如 了卵母细胞对重构胚胎后期支持发育能力；而且高效、 此多的精力，克隆的效率仍然很低，只有０．５％～１％， 省时，程序简单，所得的卵胞质更适合于供体细胞核的 而且胚胎异常率和妊娠流产率很高，很少有实验室能 重编程。应用此方法科学家先后获得了绵羊、猪、牛、 保证高效地获得活的正常克隆动物。 小鼠、兔子的体细胞克隆后代［２０～２４］。 　　影响克隆动物效率的障碍还很多，理论上对于克 　　本实验以牛体外成熟卵母细胞作为受体，胎牛成 隆动物胚胎发育机制的知识背景了解尚少，例如对外 纤维细胞和卵泡颗粒细胞为供体，通过化学药物 来植入细胞核的基因组的修饰作用和受体卵母细胞的 ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ辅 助 去 除 牛 卵 母 细 胞 核，摸 索 了 对重构胚发育的支持作用等了解得不是非常清楚，而 ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ辅助去核条件，结合整细胞胞质内注射技 这些因素都决定着克隆胚胎能否正常发育。同时，核 术，构建克隆胚胎，并观察了重构胚胎的体外发育情 移植技术通常需要借助精密昂贵的设备，需要熟练的 况，也比较了不同去核方法对于克隆胚胎发育的影响。 操作人员来完成，这在某种程度上限制了它的研究速 １　材料和方法 度和普及。所以，许多科学家开始尝试应用新的去核 　　实验所用药品如无特殊说明均购自Ｓｉｇｍａ公司。 收稿日期：２００８０８１４　　修回日期：２００８０９２３ 通讯作者，电子信箱：Ｌｉｕｄｉ１９６３＠ｓｏｈｕ．ｃｏｍ 胎牛和卵巢采集于阿城城乡四队屠宰场，Ｖｅｒｏ细胞由