血红蛋白的提取和分离.pptVIP

* 思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？ 选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。 思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？ 根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同蛋白质。 一、基础知识： ㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）： 1、概念：根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用凝胶的分子筛作用，来进行分离。 2、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长,移动速度较慢。 分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短,移动速度较快,相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。 大分子通过凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快 小分子穿过凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。 混合物 上 柱 洗 脱 大分子流动快 小分子流动慢 收 集 大分子 收 集 小分子 2、缓冲溶液的配制 通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得不同PH范围内使用的缓冲液。 NaH2PO4 / Na2HPO4 H2CO3 / NaHCO3 1、作用： 能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值 的影响，维持PH基本不变。 ㈡ 缓冲溶液： 1）原理： 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动，不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子（蛋白质，ＤＮＡ等）的分离。 2）影响蛋白质分子运动速度的因素 电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 思考：蛋白质为什么带有电荷？ 在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷 ㈢电泳： 电荷性质 电荷量 分子形状 分子大小 聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶 测定蛋白质相对分子质量通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳 2、常见方法 琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素 ②原理 ③ SDS作用 为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入SDS ,SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小 十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝 胶电泳测定蛋白质分子量 ①应用 电泳检测PCR结果 琼脂糖凝胶电泳 二 实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步： 1.样品处理 血液 血浆 水分 固体物质 血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等 血细胞 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 血红蛋白 （ ） 两个a－肽链 两个β一肽链 样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定 共四条肽链 90％ ①目的：去除（ ） ②方法： 每个肽链环绕一个亚铁血红素基团。此基团可携带O2或CO2 。血红蛋白因含有血红素而呈红色。 本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。为何不用鸡血？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，哺乳动物红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。 (1)红细胞的洗涤 杂质蛋白 (2)血红蛋白的释放 加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯（溶解细胞膜） ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白. (3)分离血红蛋白溶液：试管的溶液分为4层: 第1层（最上层）： （ ）甲苯层 第2层（中上层）： （ ）的沉淀层， （ ）色薄层固体 第3层（中下层）： （ ）的水溶液层 （ ）的液体 第4层（最下层）： 其它杂质（ ）的沉淀层 无色透明 脂溶性物质 白 血红蛋白 红色透明 暗红色 用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 透析目的：除去样品中分子量较小的杂质或用于更换样品中的缓冲液。 透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。