植物基因工程概论2.ppt

化学法诱导DNA直接转化 以原生质体为受体，借助特定的化学物诱导DNA直接导入植物细胞的方法。 化学诱导DNA直接转化的主要方法有PEG介导基因转化和脂质体介导基因转化。 物理法诱导DNA直接转化 物理转化法是基于物理因素对细胞膜的影响，通过机械损伤直接将DNA直接导入植物细胞的方法。 物理转化法主要有电激法介导基因转化、超声波介导基因转化、显微注射介导基因转化、激光微束介导基因转化、基因枪法介导基因转化等。 种质转化系统主要有： 花粉管通道法介导基因转化、生殖细胞浸泡法介导基因转化、胚囊、子房注射法介导基因转化。 种质转化系统的特点 转化的DNA可以是裸露的，也可以重组在质粒DNA上。 转化过程不依赖于物理化学过程，而依靠生物自身的种质系统或细胞功能来实现。 不需要植物组织、细胞、原生质体等的离体培养。 植物整体水平上的转化。 方法简便易行，并预常规育种紧密结合。 植物基因转化系统的选择策略 一个好的基因转化系统应该具备的特点： 转化率高；工作效率高； 宿主范围广；重复性高； 简单方便，易于操作； 快速 第四章 转基因植物的检测与鉴定 进行基因转化后，要回答以下问题： 外源基因是否进入植物细胞？ 进入植物细胞的外源基因是否整合到植物染色体上？ 整合到植物染色体上的外源基因是否表达？ 转基因植物的证据 要有严格的对照：包括阳性和阴性对照 转基因当代要提供外源基因整合与表达的分子生物学证据、物理证据、表型证据 提供外源基因控制的表型性状证据（如抗病、抗虫等） 根据该植物的繁殖方式提供遗传证据 基因转化后要进行的工作 筛选转化细胞 对转基因候选植株进行分子生物学鉴定 PCR、Southern杂交、Northern杂交、Western杂交 进行性状鉴定和外源基因的表达调控研究 转基因植株的PCR检测 外源基因是否整合可先用PCR进行检测。但因为PCR有时会出现假阳性扩增，最后的确定仍然需要用Southern杂交进行验证。 外源基因的表达可先用RT-PCR进行检测。但最后的确定仍然需要用Northern杂交进行验证。 报告基因的表达检测 报告基因：指其编码产物可被快速测定的基因。可用来追踪特定DNA结构是否已导入寄主细胞或是器官、组织。 报告基因要具备的两大特点：其表达产物或产物的类似功能在未转化的细胞内并不存在；便于检测。 报告基因的检测：生化方法或免疫方法 目前常用的报告基因 В-葡萄糖苷酸酶基因（gus基因） 抗卡那霉素基因（npt-Ⅱ基因） 绿色荧光蛋白基因（gfp)等 目的基因的的整合及表达检测 证明目的基因在植物染色体上整合最可靠的方法是分子杂交。 转基因植物分子杂交鉴定包括两部分： 核酸分子杂交： Southern杂交、Northern杂交 蛋白质分子杂交：Western杂交 核酸分子杂交的原理 非同一来源但具有互补序列的两条核苷酸链，其中一条链被人为标记，该标记可通过某种方法捡出，即成为所谓的探针。探针与互补的核苷酸链杂交后，杂交体也被带上同样的标记，可被检测出来。 这种方法灵敏度高（可捡出1pg的DNA样品），特异性强（可鉴别出20个碱基对的同源序列）。 外源基因整合的Southern杂交鉴定基本步骤 植物总DNA提取 杂交探针的制备 杂交 分析结果 Southern杂交的种类 Southern斑点杂交 可较快大略检测一下植物基因组是否含有外源基因。这种方法的主要问题是假阳性率较高。 Southern印迹杂交 可清晰而准确的显示特异杂交体的数量及位置。 Southern印迹杂交的实验程序 植物DNA的限制性酶切 凝胶电泳分离各酶切片断 各酶切片断于凝胶中变性 将变性的各DNA酶切片断转移到固相膜上 外源基因转录的Northern杂交鉴定 可检测转基因植物中外源基因的转录水平，是研究外源基因表达调控的重要手段。 Northern杂交的种类 Northern斑点杂交 是检测植物基转录本稳定表达量的有效方法，可用于外源基因表达及表达调控的研究。 Northern印迹杂交 外源基因表达蛋白的检测 外源基因编码的蛋白在转基因植物中能正常表达并表现出应有的功能是植物基因转化的最终目的。 表达的蛋白应具有一定的稳定性，不被细胞内的蛋白酶降解，同时应对植物细胞无毒性。 ELISA检测 ELISA是酶联免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay）的简称。 是一种利用免疫学原理检测抗原、抗体的技术。 由于酶反应的放大作用，使测定的灵敏度极高，可捡出1 pg的