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T载体-B载体与PCR克隆困扰 盘古基因 李万波 PCR技术给基因工程带来了巨大的变革，生物学家可以配合DNA内切酶随意放大、克隆基因。 一、T-载体与B-载体 PCR产物的克隆技术也得到了长足发展，T/A克隆载体（简称“T载体”）就是上世纪末发展起来的。Taq酶是第一个被克隆的嗜热菌DNA聚合酶，由于发现了Taq酶具有不依赖DNA模板的核苷酸末端转移酶活性，能够给双链DNA的3’-末端添加1个碱基，所以T/A克隆技术应运而生。Taq酶在dNTP俱全的情况下，优先添加1个A碱基（3’-A Protruding）, 当只有其它某个碱基时，她就退而求其次，也能加上1个其它碱基，比如“dTTP”。 PCR产物的平端连接效率本来很低，这是因为常规合成的寡核苷酸引物5’-端不带磷酸，T4 DNA连接酶只能将DNA链的3’-OH和另一DNA链的5’-P(磷酸基团)相连。DNA内切酶切开的平末端5’带有磷酸基，只有这条链能与PCR产物的3’-OH发生连接反应，另一条链没有粘性。T/A克隆时也一样，只能连接单链，另一条链上的缺口（Nick）需要受体菌（Host Bacteria）体内的激酶和连接酶帮助修补，才能成为完整的环状质粒，完成滚环复制，抵抗筛选压（抗生素毒性）。所以，如果质粒转化感受态菌后的37℃温育不够1小时，菌落数是会减少的。 上世纪80年代，拓扑异构酶