LANCEUltracAMP384中文说明书完全版.docx

LANCE Ultra cAMP 384中文说明书 完全版 1 本试剂盒用于定量检测细胞裂解液和细胞膜样品中的cAMP。 2 警惕 收到该试剂盒后，于2-8度避光保存。为了减少实验过程中的试剂蒸发，建议孵育的时候用TopSeal-A? adhesive sealing film封口。 4介绍 cAMP是最重要的第二信使之一，介导了多种生理反应，包括神经递质，激素和药物等。cAMP的细胞内浓度由两个细胞膜上的酶调节，腺苷酸环化酶（adenylyl cyclase，AC）和磷酸二酯酶（phosphodiesterase）。AC促进ATP合成cAMP，而磷酸二酯酶把cAMP降解成AMP。cAMP的激活是由不同的GTP结合蛋白偶联受体受体（GPCR）和GTP结合蛋白（Gs或者Gi）相互作用而调节。G蛋白是由Gα（i或者s）、Gβ和Gr组成的异源三聚体。GPCR激动剂使GTP和Gα结合，产生构象变化，导致Gα与Gβγ分离。分离后，Gαs主要与AC激活有关，而Gαi则是抑制AC活性。测量胞内cAMP是检测化合物对GPCR介导的AC活性的激活或者抑制作用的理想方法。 7 细胞制备 1 细胞长到70%的时候，用不含钙和镁离子的PBS洗一次，然后用5mM EDTA(PBS配制成的)37度消化5min，275g离心10min. 2 HBSS 1X重悬，计数，275g离心5min. 3 用stimulation buffer重悬细胞，按6*105个/ml的浓度稀释细胞（3000/孔）。 8 分析 步骤Gαs受体分析Gαi受体分析目的1cAMP标曲cAMP标曲确定cAMP分析的敏感性（IC50值）和动态范围（IC10-IC90）。2已知的全激动剂或Forskolin在不同细胞密度下的浓度-响应实验Forskolin在不同细胞密度下的浓度-响应实验确定最大分析窗的最佳细胞浓度，对于Gαi分析，确定Forskolin的EC90以用于激动剂分析。3激动剂的效应排名激动剂的效应排名（用Forskolin的EC90）评估激动剂的效应（EC50）和EC90，用于抑制剂的分析4抑制剂的效应排名（用激动剂的EC90）抑制剂的效应排名（用Forskolin的EC90+激动剂的EC90）评估抑制剂的效应（IC50值） 上图为Envision laser检测的cAMP标曲，采用的是four-parameter logistic equation（四参数逻辑方程），从而使准确性和精确度超过最大可用较准范围。上图中signal-to-background (S/B) 值为70，拥有1.5个log的动态范围（IC90值－IC10值） ，IC50值为1.4nM??? 因为cAMP标准曲线不是线性关系，所以有的用户会把动态范围设在IC80IC20之间。然而，由于数据是用非线性回归的方式拟合的，所以没必要把动态范围限定在线性范围内。 10 Gαs和Gαi偶联受体的最佳细胞浓度确定 选择合适的细胞浓度可以使： 降低检测窗（S/B）值