第十七章肿瘤标志畅的测定.doc

第十六章 肿瘤标志物的测定 肿瘤标志物(tumor markers，TM)是指在肿瘤发生过程中，由肿瘤组织产生、释放；或者是机体对癌类反应性的一类物质。目前主要是对TM中的肿瘤相关抗原(tumor amociated antigen，TAA)进行检测。检测TM主要方法是酶免疫测定方法(EIA)、放射免疫分析方法(RIA)和化学发光法(CL)。EIA的灵敏度可与RIA相比，而且酶标记物的保存期可长达两年以上，无放射性污染，使用较为安全，而CL具有更高的灵敏性。 实验117 放射免疫(双抗体)法测定甲胎蛋白 甲胎蛋白(AFP)为胎盘的重要血清成分，由卵黄囊肝细胞合成。胎儿出生后急剧下降，在数月至一年内下降至正常水平(＜20ng/ml)。成人再现AFP升高则提示肝细胞癌或生殖腺胚胎癌。此外，妊娠、肝病活动期，以及与胚肝、卵黄囊、胚胎胃肠道有关的少数良性疾病AFP亦可有不同程度升高。AFP对肝细胞癌诊断的临床意义可归纳为：①为各种诊断方法中专一性仅次于病理检查的诊断方法；②为目前最好的早期诊断方法，可在症状出现前6～12【】，AFP抗体(Ab)与样品中AFP及125I-AFP发生竞争性结合反应。在此反应体系中，当125I-AFP和Ab的量保持恒定，则125I-AFP-Ab复合物的形成量与非标记的AFP含量之间呈现一种逆相关函数关系，即样品中AFP含量高时，AFP对专一性Ab的结合能力强，125I-AFP-Ab复合物生成量就减少；反之，当样品中AFP含量低时， 125I-AFP-Ab复合物生成量就多。在反应达到平衡时，再用第二抗体沉淀复合物，离心分离，测定沉淀物的放射性(B)和总放射性(T)，计算各标准管的结合率(B/T)，作出剂量反应曲线(或称标准曲线)。根据样品的结合率即可从剂量反应曲线上查得样品中AFP的浓度。 【】AFP血清(第一抗体)。 2．羊抗马IgG血清(第二抗体)。 3．缓冲液： 配制含2%正常马血清的0.01mol/LPBS(pH7.4)。 4．125I-AFP：使用时稀释成10 000～12 000cpm/0.1ml。 5．AFP标准液：配制其浓度分别为0、20、50、100、200、400ng/ml的标准液。 6．正常人血清及受检人血清。 【】 表16-1 AFP放射免疫测定法操作步骤 本底 总记数管 非特异管 零标准管 标准管 测定管 反应物(ml) 1 2 3 4 5～9(20～400ng/ml) 10 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.6 标准液 － － － － 0.1 － 受检者血清 － － － － － 0.1 抗马AFP － － － 0.1 0.1 0.1 125IAFP － 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 混匀，放25℃～30℃，18～24h 羊抗马IgG － － 0.1 0.1 0.1 0.1 2．放置于25℃～30℃，1h，有明显絮状沉淀时，以3 500r/min离心15min，测各管总放射性脉冲数(T)后，弃去上清，再测定结合物的放射性脉冲数(B)。 【计算】 先计算结合率，后在反“S” 剂量反应曲线求出样品中AFP浓度。 1．结合率(%)= × 100% 2．在半对数坐标纸绘制剂量反应曲线 横轴：将AFP标准物剂量直接标于半对数的横轴上。纵轴：表示结合率，绘制成一条反“S” 剂量反应曲线。 3．计算各测定管的结合率，并查同批剂量反应曲线，求出样品中AFP浓度。 【参考范围】 0～20μg/L(0～20ng/ml) 【】1．活动性急、慢性肝炎、肝硬化或其他肝病患者，血清AFP浓度一般在500μg/L(500ng/ml)以内。若血清AFP持续上升超过500mg/L者，提示病情性质恶劣。若血清AFP浓度呈波动性改变或出现所谓“一过性”低水平升高，且随治疗而变化者，常是活动性肝病的表现特点。但对少数血清AFP长时间低水平升高，而且疗效不佳者，应注意肝硬化转恶化的可能。 2．测定AFP还可用于异常妊娠的辅助诊断。妊娠期AFP的异常升高提示胎儿患有脊柱裂、无脑畸形、食道闭锁等。在某些生殖腺胚胎性肿瘤患者血清AFP亦有不同程度的升高，应注意同原发性肝癌作鉴别。 3．国内将血清AFP测定值超过400μg/L(400ng/ml)定为诊断原发性肝细胞性肝癌的标准，但必须排除妊娠、新生儿或是活动期肝病及继发于其他脏器的肿瘤所引起的血清AFP升高。 【】I-AFP标记物，血清样品可低温保存。高脂血会使结果偏高，故应空腹采血。严重溶血的标本不能用于测定。 2．当加入第二抗原温育后，应出现明显的絮状沉淀。否则应延长温育时间，或追加第二抗体量，直到明显絮状物出现，才离心计数。 3．制作量反应曲线时，AFP 0 ng/ml的脉冲数与AFP 400ng/ml的脉冲数的比值