大肠杆菌_Escherichia_省略_oli_体外脂肪酸合成反应重建_冯赛祥.pdfVIP

TechniquesandMethods技术与方法 生物化学与生物物理进展 ProgressinBiochemistryandBiophysics 2008,35(8):954~963 大肠杆菌 体外脂肪酸 (Escherichiacoli) 合成反应的重建* ** ** *** 冯赛祥 朱 磊 罗 彪 孙益嵘 王海洪 (华南农业大学生命科学学院，广州510642) 摘要 PCR扩增大肠杆菌参与脂肪酸合成的7个主要酶基因： 、 、 、 、 、 和 ，并构建相应的 fabD fabG fabH fabA fabZ fabB fabI 表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中分别诱导表达酶蛋白，并使用Ni-NTA琼脂糖纯化到7种酶蛋白.体外添加所需酶蛋白 14 和辅因子，在不使用[2-C]丙二酸单酰CoA的条件下，成功地实现了脂肪酸合成反应的重建，另外还建立了数个鉴定有关酶 蛋白功能的标准反应，并用其鉴定了丙酮丁醇梭菌FabZ的功能. 关键词 细菌脂肪酸合成，脂酰ACP，非变性聚丙烯酰胺凝胶 学科分类号 Q93 细菌的脂肪酸合成酶属于 型脂肪酸合成酶 有多种酶催化，依次进行.每一次循环脂酰碳链增 Ⅱ 系，即脂肪酸的合成以ACP(acylcarrierprotein)为 加两个CH基团，直到形成棕榈脂酰ACP.循环 2 载体，每一步生化反应均由独立的酶催化，与高等 反应首先由NADPH依赖的 -酮脂酰ACP还原酶 # 哺乳动物拥有的 型脂肪酸合成酶系有本质的差 (FabG)催化 -酮脂酰ACP还原，生成 -羟脂酰 Ⅰ # # [1～3] 别 .正是这一差别使得细菌脂肪酸合成酶系成 ACP.接着产物脱水，生成反-2-烯酰ACP.这一 [4,5] 了当今新型抗菌药物筛选的靶位点之一 .虽然 反应 #-羟脂酰ACP脱水酶 (FabZ或FabA)催化. 细菌的脂肪酸合成体系高度保守，但是随着大量细 循环反应的最后一步是反-2-烯酰ACP还原，由 菌全基因组测序的完成，越来越多的基因注释表明 NADPH依赖烯酰ACP还原酶 (FabI)催化，生成脂 细菌脂肪酸合成存在着广泛的多样性[2,6] .目前在 酰ACP.接着开始下一循环，丙二酸单酰ACP和 细菌中已经发现了4种结构不同的烯脂酰ACP还 脂酰ACP在 -酮脂酰ACP合成酶 或 (FabB或 # Ⅰ Ⅱ [7～10] 原酶 和3条不同的在厌氧条件下合成不饱和脂 FabF)缩合成 -酮脂酰 ACP，然后依次被还原 # [11～13] 肪酸的途径 .细菌特别是病原细菌脂肪酸合成 (FabG)、脱水(FabZ或FabA)和再还原