腺病毒基因工程的实验方法学实验讲义.doc

《腺病毒基因工程的实验方法学》 实验手册 华中科技大学基础医学院病原生物学系 2014年3月 课程目的：向基础、预防、药学和临床专业，从事新药和疫苗研究、基因治疗和疾病致病机制研究的研究生传授最适用的实验方法和技术。 课程特点：以重组腺病毒技术建立实验技术平台，选课学员可全面掌握病毒基因工程技术原理和重组腺病毒基因工程技术，并了解SFDA对相关技术产品的政策要求，从基础到临床应用的综合、系统角度考虑和设计科研课题，有的放矢地进行实战培训，为进入科研提前做好相关准备。 课程设计：强调跨学科技术的综合性学习（涉及微生物学、病毒学、分子生物学、细胞生物学）强调基础研究与临床实践。 开课方式：理论讲授和实践操作相结合。利用微生物学室的科研条件（师资、场地、仪器设备、药品试剂等），完全按正式的科研要求进行严格训练。  背景介绍 《腺病毒基因工程的实验方法学》课程包含的不同种类病毒载体和及其多样性的转基因技术原理。不同种类病毒载体可分为三类： 一、质粒型载体（含病毒复制子的真核细胞表达质粒，可经物理或化学方法转染细胞后并在细胞中复制或表达，不产生感染性病毒颗粒）。 二、假型病毒载体（含有病毒复制子和病毒包装所必需的顺式作用序列的质粒，转染提供病毒反式作用序列的细胞或在辅助病毒感染细胞的情况下，可被包装成与亲代病毒外形一致、但核酸特点不同的假型病毒，具有的感染性而缺乏复制能力）。 三、重组型病毒载体（将外源基因的表达盒插入到携带病毒非必需功能基因片断的转移载体中，转染野生型病毒感染的细胞并同源重组、或直接体外基因操作将外源基因的表达盒插入到野生型病毒基因组中的特定位置，获得经过修饰的病毒基因组在细胞内表达和复制，产生具有新遗传性状的感染性病毒颗粒）。 本课程的的实践教学内容，以构建和鉴定表达颗粒溶素的复制缺陷型重组腺病毒的内容为基础，进行举例并实践其中涉及的相关内容。本实验构建的复制缺陷型重组腺病毒属于上述假型病毒载体。具体原理参见教材，宏观上分为以下步骤，在本课程将这些步骤中涉及的技术和实验，分别集中进行在不同专题进行实验。 目的基因的获取（颗粒溶素基因的引物设计、PCR扩增颗粒溶素目的基因、回收PCR产物） 基因克隆构建重组转移质粒（酶切目的基因和酶切pDC315、将酶切回收的PCR产物与同样酶切的pDC315相连接，获得连接产物、制备大肠杆菌的感受态细胞并将连接产物转化大肠杆菌的感受态细胞、筛选抗性单克隆扩大培养并提取重组质粒并进行酶切鉴定） 质粒提取（培养含骨架载体的细菌并提取骨架载体备用、提取重组转移质粒） 病毒包装（293A细胞培养、传代和冻存，重组转移质粒和骨架载体共转染293A细胞、共转染293A细胞后的扩大培养和观察细胞病变效应、第一代重组病毒的收集和处理） 重组病毒的空斑纯化或定量测定 重组病毒感染细胞表达产物的鉴定  实验一 实验室常规技术和注意事项 实验室常规技术 （一）培养基的制作 1. LB液体培养基（自制）： 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 10g 加去离子水溶解并调整pH值至7.4，1000ml，min后， 2. LB固体培养基（自制）： 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 10g 琼 脂 20g 加去离子水溶解并调整pH值至7.4，定容至1000ml，121.3℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至50℃左右后根据需要加入相应浓度的抗生素，无菌操作制作平板，4℃存放备用。 3. 10×TBE储存液： Tris-Base 54 g 硼酸 55 g 0.5 mol/L EDTA 20 ml 加入400 ml双蒸水，充分溶解后500 ml，100 mg/ml）：1 g溶于无菌水定容至10 ml，0.22 μm滤器过滤EP管，-20贮存mm/6 英寸。 安全柜的关闭 安全柜风机关闭后，柜内就被室内空气污染了，工作中不能关闭风机。当你结束工作时，遵守下列程序： 取出所有的材料，用70%的酒精擦拭柜的内部。安全柜风机工作至少10分钟，以清除污染。关闭吹风机。 盖上前罩。紫外灯照射50-60分钟净化柜的内部。 在离开实验室之前，脱去实验外罩，彻底的洗手。 在安全柜内操作 遵守微生物学实验操作要点，如保持尽可能地水平打开管和瓶子避免可能的溢出、不要吹吸滴管等。 不能在生物安全柜中使用酒精灯等，推荐使用电焚烧炉。 如果你要在安全柜内使用可产生气流紊乱的设备（如离心机，搅拌机，超声波），将设备放到安全柜的后面，当设备在工作时，停止其他操作。