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中央民族大学生命与环境科学学院 分子生物学综合性设计实验报告 2012年5月13日 小麦钙依赖型蛋白激酶ZmCPK11（CDPK）基因的克隆、表达载体构建及蛋白表达 摘要：目的：学习并掌握完整的DNA重组技术，实现从DNA到蛋白质的转化。方法：本实验运用生物信息学的方法，利用Genbank查找基因序列，利用DNAman查找酶切位点，设计引物，PCR扩增之后测序检验基因序列的正确性，并构建基因表达载体，将载体转入受体细胞大肠杆菌，表达出蛋白，用层析法纯化蛋白质用免疫印迹鉴定蛋白。结果：得到表达的大肠杆菌，并分离得到。结论：实现了从DNA到蛋白质的转化。 关键字：；表达载体； 在植物细胞中, 钙离子作为第二信使, 通过钙依赖蛋白激酶( CDPKs) 发挥功能是其传递信号的主要途径之一。CDPKs 广泛存在于植物体内, 是目前植物体内研究最深入的蛋白激酶。在植物体内, CDPKs 广泛分布于根、茎、叶、花和种子中, 在分生细胞、木质部细胞、叶肉细胞、花粉细胞、保卫细胞和胚细胞中。CDPKs 具有三个功能区, 从N 端到C 端依次为催化区、连接区和调控区。催化区由300 多个氨基酸组成, 具有典型的Ser/Thr 蛋白激酶的亚结构域, 催化区结构域的同源性较高, 一般在80% 以上。连接区由20~ 30 个氨基酸组成, 是蛋白激酶活性自抑制的区域, 也是最为保守的区域。在无Ca2+ 存在时, CDPKs 催化区可能与连接区结合, 使其激酶活性被抑制。调控区是钙结合区, 也是CDPKs 有别于其它类激酶的特有区域。此结构域与典型的CaM 序列的同源性大于40%。由于CDPKs 自身含有类似钙调素的序列, 因此其活性仅依赖于钙而不依赖于钙调素。有人甚至认为CDPKs 基因是由Ca2+ -CaM 依赖的蛋白激酶基因与CaM 基因融合而成, 这样有利于它更快地对Ca2+ 浓度变化作出反应。该区域是CDPKs 中最不保守的结构域, 大多数CDPKs 有4 个保守的EF 手性结构, 但有些CDPKs 却只有3 个EF 手性结构。CDPKs 的催化区前端, 即N 末端带有一段长短不一的序列, 称为可变结构域。各类CDPKs 在此结构域上很少有同源关系。 许多CDPKs 与CaM 有一个共性, 即可与疏水的基质结合, 如苯基-Sepharose; polypropylaspartamide gel; 固定化的酚噻嗪等，根据此特点，我们可以利用亲和层析的方法分离纯化CDPK。 一、实验原理 1.利用GenBank查找基因序列，设计引物。 2.提取总RNA，RT-PCR扩增该基因 真核细胞绝大部分RNA为rRNA（主要为28S、18S、5.8S和5S四种）（占80～85％）、tRNA与小分子RNA（占10～15％）和mRNA（占1～5％）。植物RNA的提取，主要包括以下4个步骤：①用机械研磨等方法破碎植物组织细胞；②加人蛋白质变性剂，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA；③抑制内源和外源RNase活性；④将RNA、DNA、蛋白质及其他细胞物质分开。 现在已有多种较为成熟的分离总RNA的方法，其中3种最为常用，它们分别是苯酚法、胍盐法和氯化锂沉淀法。苯酚法是用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚／氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAc和乙醇沉淀RNA。胍盐法是用异硫氰酸胍（或盐酸胍）和巯基乙醇变性蛋白并抑制RNase活性，经酚／氯仿抽提后．再沉淀RNA。氯化锂沉淀法是Li＋在一定pH下时使RNA沉淀。胍盐法RT-PCR）包括逆转录（RT）和PCR两个基本过程，逆转录是以RNA为模板的cDNA（complement DNA）cDNA作为模板而进行的PCRT-PCR可以一步法或两步法的形式进行。两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测或克隆多个基因的mRNA时比较有用。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在逆转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。而一步法RT-PCR，cDNA合成和扩增反应在同一管中进行，不需要打开管盖和转移，有助于减少污染。还可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用基因特异性引物(GSP)起始cDNA的合成。Ⅲ、EcoRV双酶切后，以T4DNA连接酶连接，16℃ ，2h，转化受体菌DH5a，筛选重组子后，Hind Ⅲ、EcoRV双酶切鉴定，筛选阳性克隆测序。 4. 转入大肠杆菌DH5a菌株中 实验以大肠杆菌DH5a菌株为受体细胞，用CaCl2处理，使其处于感受态，然后与质粒共保温，实现转化。由于质粒带有，可通过抗性来筛选转化子。如受体细胞没有