如何进行病原菌的分离.docVIP

如何进行病原菌的分离、纯培养 材料用具菌种： 米曲酶　枯草芽孢杆菌　大肠杆菌　金黄色葡萄球　白地霉　蕈状芽孢杆菌（Bacillus mycoides）粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens） 巴氏芽孢梭菌（巴氏固氮梭状芽孢杆菌，Clostridum pasteurianum） 荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）灰色链霉菌（Streptomyces griseus） 酿酒酵母 产黄霉菌（Penicillium chrysogenum）培养基：淀粉琼脂培养基 牛肉膏蛋白胨培养基(斜面、液体、半固体) 马丁氏琼脂培养基 查氏琼脂培养基 庖肉培养基 肉汤培养基 马铃薯培养基 麦芽汁酵母膏培养基溶液或试剂：10%酚，盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂，10%NaOH,灭菌的石蜡凡士林（1：1），焦性没食子酸，液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，95%乙醇，10%盐酸，无水氯化钙，食盐，干冰。仪器或其他用具：无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，链霉素和土样，显微镜，血细胞计数板，接种针，酒精灯，棉花，厌氧罐，催化剂，产气袋，厌氧指示袋，无菌的带橡皮塞的大试管，无菌的玻璃板（直径比培养皿大3至4cm），滴管，烧瓶，小刀。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　微生物的分离与纯化：一、基本原理 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。常用的方法有简易单细胞挑取法：它需要特制的显微操作器或其他显微技术，因而其使用受到限制。简易单孢子分离法是一种不需显微单胞操作器，直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。它采用很细的毛细管吸取较稀的萌发的孢子悬浮液滴在培养皿盖的内壁上，在低倍镜下逐个检查微滴。将只含有一个萌发孢子的微滴放一小块营养琼脂片，使其发育成微菌落。再将微菌落转移到培养基中，即可获得仅由单个孢子发育而成的纯培养。2.平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其原理包括两方面;选择适合于待分离微生物的生长的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法看通过稀释涂布平板或平板划线等技术来完成。值得指出的是从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发迹微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本论文采用三种不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。 方法与操作步骤： 稀释涂布平板法（1）倒平板：将肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏I号琼脂培养基、马丁琼脂培养基加热溶化，待冷至55~60℃时，马氏I号琼脂培养基中加入10%酚数滴，马丁氏培养基中加入链霉素溶液（终浓度30ug/ml），混均匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿。倒平板的方法：右手持盛培养基的试管或三角瓶置火焰旁边，用左手将试管塞或瓶塞轻轻的拔出，试管或瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住管（瓶）塞。左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，快速倒入培养基大约15ml，加盖后轻轻地摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。（2）制备土壤稀释液：称取土样10g，放入90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振荡摇20min,使土样与水分充分混合，将细胞分散。用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬浮液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混合，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成1/10、1/100、1/1000、1/10000、1/100000、1/1000000不同稀释度的土壤溶液。（3）涂布：将上述每种培养基的三个培养底面分别用记号笔写上1/10000、1/100000、1/1000000三种稀释度，然后用无菌吸管分别由1/10000、1/100000、1/1000000三管土壤稀释液中各吸取0.1ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒来回刮动，在培养