白血病NB4细胞凋亡过程中Fas蛋白和基因的表达及意义.pdfVIP

山东医药 2010年第5O卷第 11期 白血病 NB4细胞凋亡过程 中Fas蛋 白 和基 因的表达及意义 李俊武 。张树梅 ，任海全 ，李桂云 (1济钢集团有限公司总医院，济南250101；2山东省医学科学院基础医学研究所， 山东省医药卫生肿瘤免疫与中药免疫重点实验室) 摘要：目的 探讨Fas蛋白及基因表达在三氧化二砷(AsO)体外诱导急性早幼粒细胞 白血病(APL)细胞 NB4凋亡过程中的作用。方法 采用MTI法检测As：0，作用后 NB4细胞增殖情况，流式细胞仪检测 Fas蛋白表 达，RT—PCR法检测Fas基因表达。结果 经As。O，作用后，细胞增殖受抑，细胞凋亡明显，Fas蛋白及基因表达均 升高。结论 Fas蛋白及基因高表达在AsO诱导NIM细胞凋亡过程中起关键作用。 关键词：NB4细胞 ；三氧化二砷；凋亡；Fas蛋白；Fas基因 中图分类号：R733．7 文献标志码：B 文章编号：1002-266X(2olo)11-0060-02 白血病是一类造血干细胞 的克隆性恶性疾 min离心，弃上清，加人二甲基亚砜 150 l／，孔，置微 病…。1996年陈竺等首次报道三氧化二砷(As：0，) 量板式振荡器震荡至甲躜颗粒完全溶解 ，酶标仪上 可引起急性早幼粒细胞 自血病 (APL)细胞凋亡， 检测 A值，570nm为检测波长，630nln为参考波 As20对APL细胞表现为双重作用，低浓度 (0．1— 长，计算细胞增殖抑制率 (％)=(对照组A值 一实 0．5la,moVL)诱导细胞部分分化，高浓度 (2．0 验组A值)／对照组A值X100％。 t~nol／L)则诱导细胞凋亡_2．3J。Fas／FasL途径是介 1．3 细胞形态观察 以含 10％胎牛血清的 1460 导细胞凋亡的主要受体途径之一。某些型别的白血 培养液传代培养NB4细胞，将细胞浓度调整为 1× 病细胞可表达Fas抗原，且对 Fas／FasL途径的致凋 10／ml，加入终浓度为2ixmoL／L的As203，置37℃、 亡作用敏感。Fas／FasL系统不仅与 白血病的发生、 5％CO、饱和湿度培养箱中培养，3d后将细胞离 发展有关，亦与 白血病的治疗密切相关。2008年 3 心，用PBS重悬沉淀，取一滴细胞悬液制成涂片，姬 月～2009年 5月，我们将As0，作用于APL的NB4 姆萨一瑞氏染色后显微镜下观察细胞形态。 细胞，检测了Fas基因和蛋 白的表达，旨在探讨Fas 1．4 Fas蛋 白表达检测 将细胞浓度调整为 1x 基因和蛋白在细胞凋亡中的作用。 10／ml，加入终浓度为2~mol／L的As203，置37cC、 1 材料与方法 5％CO饱和湿度培养箱中培养，3d后将细胞离心， 1．1 材料 RpMI1640(Gibco)用双蒸水配制成含 PBS洗2遍，加入FITC标记的Fas抗体 5O l，作用 10％胎牛血清，100U／ml青链霉素、300mg／LL．谷 30min后流式细胞仪检测。以不加药细胞为阴性对 氨酰胺的完全培养液。As：O，(Sigma)用 10％NaOH 照。 溶解后用 1640配成2mmol／L母液。Trizol提取液、 1．5 Fas基 因表达检测 采用 RT—PCR法。2 RT—PCR所需试剂及引物均购 自TaKaRa公司和上 txmol／L的As2O3处理细胞 3d后，Trizol法抽提细 海生物工程技术服务有限公司，PI购 自晶美公司， 胞总RNA。紫外分光光度仪检测所抽提 RNA的浓 Fas抗体购 自BD公司。实验所用细胞株为急性早 度和纯度合格后，采用 MMLV—ReverseTranseriptase 幼粒白血病细胞NB4细胞株。 逆转录酶将RNA逆转录为eDNA，以eDNA为模板 1．2 细胞增殖检测 采用M1-r法。取对数生长期 进行PCR反应，总体系为5O l，PCR产物用 1．2％ 细胞 100 l(5X10／m1)接种于96孔培养板，然后