疟疾诊断技术研究概况.doc

疟疾诊断技术研究概况 疟疾诊断技术主要包括病原形态学检查、血清免疫学检查、DNA探针检测和PCR检测。以形态学检测为主要内容的血涂片显微镜检查，是一种传统的诊断技术，迄今仍是多数基层医疗单位主要或唯一的诊断手段，其检测敏感度可达到10~20个原虫/μl血，方法简便、经济，适于基层应用，目前疟原虫镜检仍然是WHO推荐的疟疾诊断金标准；缺点是结果判断受检验人员镜检水平和视力疲劳程度等因素的影响，对于低原虫血症或混合感染病例容易漏诊或误诊，且检查效率不高。一个镜检员每天最多只能检查70~80张血片。免疫学诊断技术和单克隆抗体检测技术的发展，特别是20世纪80年代以后分子生物学技术的研究，为疟疾诊断提供了良好的技术手段。 1 免疫学检测 随着免疫学技术的发展，疟疾的血清学检测方法已在疟疾防治实践中被广泛应用。目前用于疟疾诊断的检测方法主要包括抗体检测和抗原检测。 1.1 检测血中抗体 在间日疟的检测中，间接荧光抗体试验（IFA）的敏感性虽然不是最高（82.5%）但特异性最好，与正常人血清，华支睾吸虫病人和囊虫病人血清均不出现交叉反应。酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫酶染色试验（IEST）也具有很高的敏感性和特异性。相比而言，胶体金凝集试验（CGAT）和胶乳凝集试验（LAT）检测效果较差。研究显示，用斑点ELISA法检测恶性疟时，敏感性达100%，显示了较好的应用前景。 检测血清抗体在流行病调查和监测疟防效果方面有着重要的意义，但由于血清抗体往往在疟疾发作1周以后才开始升高，故该项检查只能判断疟史，不易用于现症病人的诊断。 1.2 检测血中抗原 Mackey和Avraham检查p.f.感染者血中抗原，敏感度达到了8个原虫/106红细胞，接近镜检水平。但在实际应用时，假阳性却高达14.0%。研究显示抗p.c.抗体可以替代p.v. 混合抗体用于血中p.v.抗原检测。 单克隆抗体在疟疾检测中的研究和应用，为疟疾血清学诊断提供了新的材料。Dipstick, ACT, 等一些疟疾快速诊断产品相继问世，经过不断改进和提高，免疫学检测抗原的方法敏感性和特异性均较高，已经可以大规模实际应用，目前主要存在一是价格较高的问题，二是保存不长，三是国内尚无类似产品。 核酸探针检测 与免疫学检测相比较，DNA探针的检测是在基因水平而非基因的表达产物，避免了表达产物在质和量上的差异，而且便于早期诊断。DNA探针检测每天可处理上千份样品，与镜检相比，提高了工作效率，因此从一开始就受到人们的关注。 2.1 全基因组DNA探针 直接提取疟原虫全基因组DNA，32P标记后用探针，它的最大优点是制备简单，敏感性好。由于同属中不同虫种DNA同源性较高，易于发生交叉杂交，因此全基因组DNA探针只宜作为疟原虫属的通用探针，而不能定种。 2.2 重组质粒DNA探针 分离提取全基因组DNA,用限制性核酸内切酶消化,克隆到嗜菌体或中质粒载体中,构建全基因组DNA文库,再以同种原虫总DNA为探针进行筛选,从中获得杂交信号较强的、含有高度重复序列的克隆片段,标记后用作探针。与全基因组DNA探针相比,该探针的优点是敏感性、特异性均较好。 2.3 人工合成寡核苷酸探针 因合成探针需要特殊的设备，且费用较高，合成的探针长度有限，故这方面的研究开展较少。 从总体上看，DNA探针的敏感度只有50~5000个原虫/μl血，且操作繁琐，费时，对实验技术人员和实验室条件要求较高。探针标记目前多采用放射性同位素32P，虽然敏感性和特异性较好，但价格昂贵，半衰期短（14.5d），临用时标记不便保存，且有放射线污染，在操作和废物处理方面都有特殊要求等等，使探针检测的研究还仅限于实验室阶段而未能在实际应用中广泛推广。虽然不少学者在非放射性标记方法如异羟基洋地黄毒苷配基，地高辛配基，生物素标记，酶直接碱基连接等方面也作过一些研究，但与同位素标记探针相比，敏感性较低，特异性较差，本底高和非特异性着色等，其应用受到了限制。 聚合酶连反应（PCR） 1985年PCR技术问世，20世纪90年代以后，疟疾PCR检测的研究在我国相继展开。PCR检查高效简便，敏感性和特异性较高，明显优于形态学、免疫学、和核酸探针检测，受到各实验室的广泛重视。 PCR检测的特点 1）高度敏感性。通过体外扩增，使得特异性靶DNA序列在数小时内成百万倍的增加，大大提高了检测的敏感性。研究显示，无论是在实验室还是在现场，对疟疾的检出率都达到了100%，并且大大高于镜检的敏感性。2）高特异性。研究显示，PCR检测疟疾不仅假阳性和假阴性极少，而且具有疟原虫种、株的鉴别能力，且能方便地检测出镜检漏诊的混合感染，与p.c.、约氏疟原虫、b.p.和人白细胞DNA均不出现交叉杂交；3）检测效率高。与其它检测技术相比，具有方法