VEGFA及其受体VEGFR1与子宫内膜癌生物学行为关系的探讨.docVIP

VEGFA及其受体VEGFR1与子宫内膜癌生物学行为关系的探讨 【摘要】 目的：检测50例子宫内膜癌组织及癌旁正常内膜组织的VEGFA和VEGFR1的表达情况，探讨VEGFA及其受体VEGFR1是否与子宫内膜癌的侵袭与转移有关。 方法 ： 采用RTPCR技术对50例癌组织及癌旁正常组织进行VEGFA和VEGFR1 mRNA 半定量检测；采用Western blot进行其蛋白质表达的半定量检测。结果：癌组织VEGFＡ 和VEGFR1 mRNA表达水平及蛋白质水平均明显高于癌旁正常内膜组织；VEGFＡ和VEGFR1的高表达与子宫内膜癌肌层侵袭的深度有关，与淋巴结的转移无关；低分化癌组织VEGFＡ的表达明显高于中、高分化，VEGFR1的表达与细胞分化无关。结论： VEGFＡ及其受体VEGFR1的高表达可引起子宫内膜癌的肌层侵袭；癌分化越差，VEGFＡ表达越高。 【关键词】 血管内皮生长因子 血管内皮生长因子受体 子宫内膜癌 侵袭与转移 子宫内膜癌的侵袭与转移明显 影响 着病人的预后，而肿瘤血管的生成是肿瘤侵袭与转移所必须； 研究 表明，VEGFA可诱导血管生成［1］。本研究就50例子宫内膜癌患者的癌组织及癌旁正常内膜的VEGFA及其受体VEGFR1的表达进行检测，以探讨它与子宫内膜癌生物学行为的关系，现报道如下。 1 资料与方法 1.1 一般资料 50例子宫内膜癌及癌旁正常内膜组织标本取自2004年3月至2006年12月间在南京大学医学院附属鼓楼 医院 的住院患者。年龄42～77岁，平均55岁。手术病理分期:a 2例，b 16例，c 15例，a 6例，b 2例，a 2例，c 7例。子宫内膜腺癌组织学分级：G1 11例，G2 20例，G3 19例。 1．2 标本采集 子宫离体后立即纵行剖开，取癌组织约2 cm×1 cm大小,在癌组织基底部2 cm外侧取正常内膜约2 cm×1 cm大小。标本立即放入液氮罐中，-70 冰箱中保存。 1．3 采用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）检测mRNA的表达1．3．1 总RNA的提取与鉴定 每例标本取100 mg组织置于玻璃匀浆器中，采用Trizol一步法提取总RNA，样品经分光光度计检测吸光度A值，根据A值 计算 总RNA浓度，并行热稳定图像 分析 系统扫描各电泳带的灰度值，计算VEGFA和VEGFR1与βactin的灰度值的比值，即为癌组织和癌旁正常内膜组织的mRNA表达水平。 1．3．2 引物及试剂 设计的引物由上海生物工程公司合成。VEGFA扩增的上游引物为5′GCAGAAGGA GGAGGGCAGAATC3′，下游引物为5′ACACTCCAGG CCCTCGTCATT3′，扩增片段长度为197 bp。VEGFR1扩增的上游引物为5′CAAGTGGC CAGAGGCATGG AGTT3′，下游引物为5′GATG TAGTCTTTACCATCC TGTTG3′，扩增片段长度为498 bp。以βactin为内参照，上游引物为5′TT CCAGCCTTCCTTCCTGG3′，下游引物为5′TTGCGCT CAGGAGGAGCAAT3′，扩增片段长度为224 bp。 Trizol试剂、RNA酶抑制剂、MMIV逆转录酶及Taq DNA聚合酶均购自上海生物工程公司。 1．3．3 RTPCR 逆转录反应体系为30 μl，RNA模板量为10 μg，采用随机引物法将RNA逆转录为cDNA，在PTC200PCR扩增仪上扩增。总反应体积为50 μl，每管加10 mmol·L-1 VEGFA或VEGFR1上下游引物各1 μl，10 mmol·L-1βactin上下游引物各1 μl，10×PCR缓冲液5 μl，15 mol·L-1MgCl2 4 μl，TaqDNA酶0.4 μl，加水至50 μl。VEGFA反应条件为：94 变性1 min；56 退火1 min，72 延伸1 min，30个循环；复性5 min。VEGFR1反应条件为：94 变性1 min；62 退火2 min，72 延伸3 min，35个循环；复性5 min。 1．3．4 PCR产物测定 取10 μl PCR反应产物在2%的琼脂糖凝胶中电泳（120 V）30 min，在紫外灯下观察扩增的特异条带，凝胶图像分析系统扫描各电泳带的灰度值，计算VEGFA和VEGFR1与βactin的灰度值的比值。 1．4 Western blot检测蛋白质表达 称取的组织标本0.5 g与500 μl的 RIPA组织裂解液加入玻璃匀浆器中，在冰中进行组织匀浆，4 、12 000 g离心10 min，取其上清液，各标本取50 μl测蛋白浓度（Brandford法），调整各标本蛋白质量浓度为2 mg·L-1。取调整浓