CTCs检测.ppt

循环肿瘤细胞（CTCs）的检测技术与应用 临床应用 目前在乳腺癌研究中价值大 检测技术：液体微球杂交（主要），RT-PCR、细胞学方法。 操作过程与方法 一、细胞富集（外周血） 1.物理分离——膜过滤、密度梯度离心 2.免疫磁珠分离 阴性分离 阳性筛选 二、目的基因的提取 1、CTC和PBMC中分离总RNA，溶解于20微升RNA储存液，-70℃保存。 2、cDNA合成：mRNA做模板通过RT-PCR进行合成。（放大HMBS基因来测试RNA完整性）；-20℃保存。 三、多重PCR扩增 多重PCR技术：在一个反应体系中同时扩增多个目的片段的PCR技术（具有高特异性、高灵敏度、高效率、低成本的特点，适合大量样本的分析与鉴定。） 多重PCR技术要素 目的片段具有高度特异性 避免目的片段间的竞争性扩增 目的片段间具有明显长度差异 各引物高度特异，避免引物之间互补 控制复性温度，允许范围内较高复性温度可减少非特异性扩增 延伸时间不宜过长 适当调整反应条件 引物设计：上游引物由T7扩增序列（5-TAATACGACTCACTATAGGG-3）和约20个核苷酸的基因特异性序列组成；下游引物由约20个核苷酸的基因特异性序列和T3扩增序列（5-ATTAACCCTCACTAAAGGGA-3）组成。 原料：12.5微升反应混合液、2.5微升Q-solution、两种引物各0.08微升、2微升cDNA（最终体积25微升？） 程序：95℃ 15min；35次循环：95℃ 30″； 60℃ 1min；72℃ 30″；72℃ 10min；4℃保存 四、PCR产物生物素化 原料：2微升多重PCR产物 18微升反应体系：1μl 2μ mol/l生物素化 的T7溶液；0.4μl 10mmol/l脱氧核苷酸三磷酸盐；1μl 50mmol/l Mgcl2；0.2μl 5u/μl铂Taq DNA聚合酶；13.4μl焦碳酸二乙 酯处理的水。 程序：变性95℃5分钟; 10个循环，95℃30秒，退火60℃30秒，延伸72℃30秒; 在72℃最终延伸步骤为10分钟 五、基因特异性捕获探针与荧光微球藕联 （共价交联） 六、液体微珠阵列杂交 原料：2500微珠；6个基因靶标结合物；1.5xTMAC缓冲液[4.5 mol / L的氯化四甲基铵，1.5 g / L的SDS，75毫摩尔/ L的Tris（pH8.0），和3.0毫摩尔/ L EDTA（pH8.0）]；PCR扩增产物7μl（最终体积43μl） 过程：95℃下2分钟；60℃60分钟；微量离心（11 340g ？）4min；去上清；悬浮于75μl的reporter 溶液中；室温下放置15min 七、珠分析 悬浮微球置于96孔板中，在luminex 100仪器上进行分析；样品体积设定50μl、流速60μl/min；记录最少100个事件进行计算输出。 液体微球杂交的特异性与灵敏性测试（Fig2） 1、6种不同微球和单一基因杂交（不同微球对相同基因的特异性） 2、6种微球和5种生物素化PCR产物混合杂交？（不同微球对多种基因的特异性） 3、改变检测细胞浓度，验证检测极限（研究液体微球杂交的敏感性） 检测杂交试验的精度（Table1） 批内变异：从100个SK-BR-3细胞和100个MDA-MB-231细胞中分离出的RNA进行3次平行测定。变异系数介于0.5%至10% 批间变异：同一cDNA样本（-20℃保存）在一个月内不同的5天进行5次单独的测试。变异系数介于6.8%至17% 临床评价测试方法（4种） 测试不同微球KRT19，MAGEA3，SCGB2A2，TWIST1，ERBB2在可手术治疗乳腺癌、转移性乳腺癌、和健康者之中的表达分数（Fig3 A） ？（Fig3 B） 测试不同微球KRT19，MAGEA3，SCGB2A2，TWIST1，ERBB2在乳腺癌患者和健康个体的ctc中表达比例。（Fig4） 比较乳腺癌患者中CTC基因在KRT19，ERBB2液体微球阵列和RT-qPCR中表达结果一致的概率。（Table2） * * 反映原发肿瘤的侵袭程度，肿瘤远处转移的早期诊断指标，肿瘤疗效评价和预后指标 多重PCR过程 *