第五篇： 就这样做 轻松搞定实时 PCR 探针设计.docxVIP

除了为克隆基因、预测编码蛋白而需要研究基因的构成外，当前在基因组学上的努力也包括对基因组构成的研究，以分析具有结构和调控因子插入的基因。近源物种分析成为比较基因组学的主要内容，被认为是研究进化、基因功能和人类疾病的重要方法。利用该方法分析微生物，特别是细菌的基因组，早在 1996 年就已开始识别出细菌中的保守基因和与亚种相关的毒性基因（Fredricks and Reiman 1996)。这方面的进展促生了新的、大规模的检测和识别致病菌的方法。近源种 PCR 可以用来研究进化上相关的种，它们在基因组上有一 些共同的特点，这些保守的区域可被用于在基因组水平识别新种。还可以用该技术在尚未测序的物种的基因组中扩增同源基因。设计策略根据多元序列比较和引物设计的一般规律来设计近源种 PCR 引物。通过比较少数几个大的相近序列识别出保守区域，这些区域即是近源种引物的可能结合位点。近源种的比较需要对少数大的相近序列进行精确比对，通过比对 找到保守区，作为可能的近源种引物的设计位点。 引物向保守区的退火可被用于在不同种中扩增同源位点（见图 1)。应遵循以下步骤。图11. 利用多重序列比对软件如 Clustal (http: //www. ebLac.uk/clustalw) 对所选序列进行多重比较。Clustal 的使用教程，点击访问：序列比对之 Clustalx 与 Clustalw 使用指南2. 推测比对中的保守区域。通过选择保守序列的每个位置上最常出现的核苷酸，导出 其共同引物。3. 引物的结合位点应该完全位于保守区域内。对于亲缘关系较远的种，如果序列不是非常保守，可以设计匹配程度较低的探针或引物。引物的 5端允许有一定的简并性，但 Y 端的错配将降低退火的特异性和 PCR 的产量（Sommer and Tautz 1989)。4. 按照 PCR 引物设计的一般规律，避免近源种 PCR 中引物的错配和引物二聚体的 形成。实时 PCR 探针设计实时 PCR 的应用使得在 PCR 扩增过程中，就能对核酸的起始量进行精确定量，从而不必进行后 PCR 分析。在实时 PCR 扩增过程中，用荧光指示剂从 PCR 的起始阶段就开始对 PCR 监测。 随着扩增轮数的持续增加，产物逐渐积累，进而报告分子的荧光也就随之增强。标记物可以是非特异性的双链 DNA 插入结合染料或序列特异的荧光标记的寡核苷酸探针，寡核苷酸探针用报告荧光染料和猝灭染料标记。当探针完整时，通过 Forster 共振能量转移（FRET) 作用，猝火物与报告染料的接近大大减少了后者向空间进行的荧光发射，从而会观察到 5 端有报告物、3端有猝火物的探针有足够的猝火效应。当探针分子结合进复制子中时，猝火效应被破坏，探针发出荧光。图2对 PCR 的进程进行实时监测的能力使得以 PCR 为基础的 DNA 和 RNA 定量方法取得突破性进展。通过消除常规定量技术的可变因素的影响，目前已能较可靠地对 PCR 产物进 行定量。由于在外部即可检测荧光，因此不必在反应结束后打开管盖，因而防止了气体浮质 的污染，减少了假阳性结果的数量。1. 双标 TaqMan 定量分析 (定量 pcr 探针法引物设计)一个流行的实时 PCR 探针策略是 TaqMan 分析（Applied Biosystems)，该实验利用水解探针，它可利用聚合酶的核酸外切酶活性在 PCR 扩增的延伸阶段中切开被标记的杂交探针（Holland etal. 1991)。（1）设计策略荧光 5-核酸酶分析是一个方便而完备的过程。探针被设计为与目的序列退火于上下游引物之间。探针的 5 端用报告荧光染料.(通常为 6-碳氧荧光素 [6-FAM]) 标记，3端或任意一个 T 碱基位点用猝火染料（6-羧基-四甲基-罗丹明 [TAMRA]) 标记。图3PCR 扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一线性的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告 基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收， PCR 仪检测不到荧光信号； PCR 扩增时（在延伸阶段）， Taq 酶的 5 － 3 外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条 DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与 PCR 产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。由于报告基团是随着 PCR 扩增而逐步释放的，因此整个体系的荧光密度值与扩增的 DNA 量成正比。当设计 TaqMan 探针时，应考虑以下问题。（1）探针的 3 端必须保护以防止其在 PCR 扩增时延伸。可以利用 3-脱氧腺苷、2, 3双脱氧核苷，插人 T 或猝火染料本身封闭 3端的磷酸基。TAMRA 或另一个猝火物对 3端