芍药基因组DNA不同提取方法比较和PCR验证.docVIP

芍药基因组DNA不同提取方法的比较及PCR验证 　　摘 要：提取基因组DNA是开展芍药分子生物学研究中一项最为基础的工作。本研究通过常规CTAB法和近几年应用较为普遍的试剂盒法，对芍药基因组DNA进行了提取，并对2种方法所提取的DNA进行了浓度、程度、琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增比较。结果表明，常规CTAB法提取的DNA浓度较高，为128.08-253.63 ng/ul，但纯度较低，而试剂盒法提取的DNA虽平均浓度较低，为3.51ng/ul，但纯度较高；电泳和PCR结果均表明，试剂盒法提取的DNA能扩增出目的片段，是较好的一种提取方法 关键词：芍药；DNA；CTAB法；试剂盒法 芍药（Paeonia lactiflora），芍药科芍药属多年生草本植物。原产中国以及亚洲北部，不仅有较高的观赏价值，更有重要的药用价值[1，2]，芍药根中的芍药苷具有扩张血管、镇痛镇静、抗炎、解痉等功效[3，4]。分离芍药相关基因，研究其表达特征，对芍药分子育种工作及抗类风湿作用的分子机制研究具有重要意义[5，6]。提取基因组DNA则是一项最为基础的工作，DNA提取质量的好坏，对后期的研究起着重要的影响。本研究通过常规CTAB法和近几年应用较为普遍的试剂盒法，对芍药基因组DNA进行提取，通过2种方法的比较，以寻求较好的提取方法 1 材料与方法 1.1 供试材料 供试材料芍药嫩叶，采自三门峡牡丹苑 1.2 方法 1.2.1 CTAB法提取DNA。（1）称取100mg芍药嫩叶，加入液氮内研磨至粉状，加入700μL的CTAB缓冲液，混匀；（2）置于65℃恒温水浴锅中水浴加热30min，其中每隔5min轻轻摇动，使水浴充分；（3）高速离心机中12000rpm离心10min；（4）小心取出，吸取上清液，加入酚-氯仿-异戊醇（25?U24?U1）700μL，使其充分混匀；（5） 12000rpm离心10min；（6）小心吸取上清，转入新的EP管中，再加入酚-氯仿-异戊醇700μL，振荡混匀；（7）12000rpm离心10min；（8）吸取上清液，转入新的EP管中，加入预冷的无水乙醇，-20℃过夜沉淀；（9）12000rpm离心2min，70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，倒置30min，100μLddH2O溶解 1.2.2 试剂盒提取DNA。（1）称取芍药嫩叶100mg，加入液氮充分研磨至粉状，将研磨好的粉末迅速转移至预先装有700μL预热缓冲液的GP1的离心管中；（2）迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃恒温水浴锅中水浴30min，水浴过程中每隔5min混匀；（3） 30min后加入700μL氯仿充分混匀，12000rpm离心10min；（4）小心将上层水相转移至新的EP管中，加入700μL缓冲液GP2充分混匀；（5）将混匀的液体转移至吸附柱中，12000rpm离心2min，弃掉废液；（6）向吸附柱中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；（7）向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心2min；（8）倒掉废液，将吸附柱放入收集管中，重复清洗步骤，倒掉废液；（8）离心5min；（9）将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的漂洗液；（10）将晾干后的吸附柱放入一个新EP管中，100μLddH2O溶解后离心10min，将溶液收集到离心管中 1.2.3 DNA的浓度和电泳检测。在紫外分光光度计中测定核酸浓度，取2μL提取的DNA进行电泳检测，1%琼脂糖凝胶，凝胶成像仪中观察结果 1.2.4 ITS片段的扩增。分别以2种方法所提取DNA样品为模板（CTAB法提取的DNA稀释10倍），进行ITS片段的扩增。ITS引物序列为：上游引物序列5′- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′，下游引物序列5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。PCR反应体系为20μL，10×buffer2μL，dNTPmix1.6μL，Taq酶0.1μL，Primer各1μL，DNA模板0.5μL，ddH2O13.8μL。扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸60s，28个循环， 72℃延伸10min 2 结果及分析 2.1 2种方法提取后DNA浓度的比较 对2种方法提取的DNA进行浓度检测，结果如表1所示 由表1可知，利用CTAB法提取的DNA浓度较高，为128.08～253.63 ng/μ，而试剂盒法提取的DNA浓度较低，在0.87～6.14 ng/μ范围内，平均浓度3.51ng/μ 2.2 电泳检测和PCR扩增结果比较 将2种方法所得的DNA样品2μl点样，检测结果如图1所示，PCR